Name: אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: למדו הכנת פרוסות מגרעין suprachiasmatic בעכברים טרנסגניים וגידול רקמות אורגנוטיפי עם הקלטת לוציפראז. שיטה זו מאפשרת מעקב רציף אחרי ביטוי גני השעון ביולוגי ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי המועצה למחקר רפואי שוודית (K2009-75SX-21028-01-3, K2008-61X-20700-01-3); FONCICYT 000000000091984; יסודות Jeansson, Söderström Königska sjukhemmet, מרתה Lundqvist ו סיגורד och אלזה Goljes Minne; חברה שוודית לרפואה SLS-95151. פרופ &#39;ג&#39;ין ד בלוק, UCLA, היא הודתה בהכרת תודה על הערות מועילות על כתב היד. אנו מודים ד&quot;ר מיכאל Andäng וד&quot;ר הלנה Johard עבור חוסם את הערוץ HCN, פרופ &#39;עבד אל Manira לאספקת מיקרוסקופ וידאו. שיקולים אתיים: כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי קרולינסקה Institutet ו &quot;Norra של שטוקהולם Djurförsöksetiska Nämnd&quot;. כל הניסויים בבעלי חיים מבוצעות מתוך כוונה למזער את כל הלחץ האפשרי או חוסר נוחות לבעל החיים.

<ol><li>Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suprachiasmatic+nucleus%3A+cell+autonomy+and+network+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties.</a> Annu Rev Physiol. 72, 551-577 (2010).</li>
<li>Green, D. J., Gillette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+firing+rate+recorded+from+single+cells+in+the+rat+suprachiasmatic+brain+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of firing rate recorded from single cells in the rat suprachiasmatic brain slice.</a> Brain Res. 245, 198-200 (1982).</li>
<li>Shibata, S., Oomura, Y., Kita, H., Hattori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythmic+changes+of+neuronal+activity+in+the+suprachiasmatic+nucleus+of+the+rat+hypothalamic+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythmic changes of neuronal activity in the suprachiasmatic nucleus of the rat hypothalamic slice.</a> Brain Res. 247, 154-158 (1982).</li>
<li>Groos, G., Hendriks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+in+electrical+discharge+of+rat+suprachiasmatic+neurones+recorded+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms in electrical discharge of rat suprachiasmatic neurones recorded in vitro.</a> Neurosci Lett. 34, 283-288 (1982).</li>
<li>Klein, D., Moore, R., Reppert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+suprachiasmatic+nucleus+and+the+circadian+timing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Suprachiasmatic+nucleus--The+mind%27s+clock%22%5BJournal%5D)">The suprachiasmatic nucleus and the circadian timing system.</a> Suprachiasmatic nucleus--The mind's clock. , Oxford University Press. New York. 13-15 (1991).</li>
<li>Pol, A. N. V. anden <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+suprachiasmatic+nucleus+of+rat%3A+intrinsic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic suprachiasmatic nucleus of rat: intrinsic anatomy.</a> J Comp Neurol. 191, 661-702 (1980).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Yamazaki, S., Numano, R., Abe, M., Hida, A., Takahashi, R., Ueda, M., Block, G. D., Sakaki, Y., Menaker, M., Tei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats.</a> Science. 288, 682-685 (2000).</li>
<li>Geusz, M. E., Fletcher, C., Block, G. D., Straume, M., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kay, S. A., RN, D. ay <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+monitoring+of+circadian+rhythms+in+c-fos+gene+expression+from+suprachiasmatic+nucleus+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-term monitoring of circadian rhythms in c-fos gene expression from suprachiasmatic nucleus cultures.</a> Curr Biol. 7, 758-766 (1997).</li>
<li>Ko, C. H., Buhr, E. D., Siepka, S. M., Hong, H. K., Oh, W. J., Yoo, O. J., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 5339-5346 (2004).</li>
<li>Yamazaki, S., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+luminescence+reporting+of+circadian+gene+expression+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals.</a> Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).</li>
<li>Yoshikawa, T., Yamazaki, S., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preparation+time+on+phase+of+cultured+tissues+reveal+complexity+of+circadian+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Effects of preparation time on phase of cultured tissues reveal complexity of circadian organization.</a> J Biol Rhythms. 20, 500-512 (2005).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (1997).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The rat brain in stereotaxic coordinates</a>. , 4 Edition, Academic Press. San Diego. (1998).</li>
<li>O'Neill, J. S., Maywood, E. S., Chesham, J. E., Takahashi, J. S., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-dependent+signaling+as+a+core+component+of+the+mammalian+circadian+pacemaker%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker.</a> Science. 320, 949-953 (2008).</li>
<li>Hughes, A. T., Guilding, C., Lennox, L., Samuels, R. E., McMahon, D. G., Piggins, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+altered+period1+expression+in+the+suprachiasmatic+nuclei+of+Vipr2-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Live imaging of altered period1 expression in the suprachiasmatic nuclei of Vipr2-/- mice.</a> J Neurochem. 106, 1646-1657 (2008).</li>
<li>Zhang, D. Q., Zhou, T., Ruan, G. X., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythm+of+Period1+clock+gene+expression+in+NOS+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythm of Period1 clock gene expression in NOS amacrine cells of the mouse retina.</a> Brain Res. 1050, 101-109 (2005).</li>
<li>Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+clock+nucleus%3A+a+multiphasic+oscillator+network+regulated+by+light%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The biological clock nucleus: a multiphasic oscillator network regulated by light.</a> J Neurosci. 23, 8070-8076 (2003).</li>
<li>LeSauter, J., Yan, L., Vishnubhotla, B., Quintero, J. E., Kuhlman, S. J., McMahon, D. G., Silver, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+half-life+GFP+mouse+model+for+analysis+of+suprachiasmatic+nucleus+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A short half-life GFP mouse model for analysis of suprachiasmatic nucleus organization.</a> Brain Res. 964, 279-287 (2003).</li>
<li>Nakamura, W., Yamazaki, S., Takasu, N. N., Mishima, K., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+Period+1+expression+within+the+suprachiasmatic+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential response of Period 1 expression within the suprachiasmatic nucleus.</a> J Neurosci. 25, 5481-5487 (2005).</li>
<li>Davidson, A. J., Yamazaki, S., Arble, D. M., Menaker, M., Block, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+central+and+peripheral+circadian+oscillators+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Resetting of central and peripheral circadian oscillators in aged rats.</a> Neurobiol Aging. 29, 471-477 (2008).</li>
<li>Croning, M. D., Haddad, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+brain+slice+chamber+designs+for+investigations+of+oxygen+deprivation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of brain slice chamber designs for investigations of oxygen deprivation in vitro.</a> J Neurosci Methods. 81, 103-111 (1998).</li>
<li>Burgoon, P. W., Boulant, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+properties+of+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive properties of rat suprachiasmatic nucleus neurons.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 281, 706-715 (2001).</li>
<li>Nishide, S. Y., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+pacemaker+in+the+cultured+suprachiasmatic+nucleus+from+pup+mice+is+highly+sensitive+to+external+perturbation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The circadian pacemaker in the cultured suprachiasmatic nucleus from pup mice is highly sensitive to external perturbation.</a> Eur J Neurosci. 27, 2686-2690 (2008).</li>
<li>Yoshikawa, T., Sellix, M., Pezuk, P., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+the+ovarian+circadian+clock+is+regulated+by+gonadotropins%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Timing of the ovarian circadian clock is regulated by gonadotropins.</a> Endocrinology. 150, 4338-4347 (2009).</li>
<li>Kohn, R. A., Dunlap, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+the+buffering+capacity+of+bicarbonate+in+the+rumen+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of the buffering capacity of bicarbonate in the rumen and in vitro.</a> J Anim Sci. 76, 1702-1709 (1998).</li>
<li>Wilsbacher, L. D., Yamazaki, S., Herzog, E. D., Song, E. J., Radcliffe, L. A., Abe, M., Block, G., Spitznagel, E., Menaker, M., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photic+and+circadian+expression+of+luciferase+in+mPeriod1-luc+transgenic+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 489-494 (2002).</li>
<li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fluminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25, 228-232 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

יתרונות וחסרונות עם טכנולוגיית הכתב בלוציפראז בניגוד לשיטות לשעבר vivo, כגון RT-PCR, ב הכלאה באתרו כתם המערב שדורשים דגימה רקמה על רבים בנקודות זמן שונות (מתן החלטה זמן נמוכה בדרך כלל 2-4 שעות, תלוי תדר הדגימה) כדי ללמוד יומי וריאציות ביטויי גנים וחלבונים, הטכנולוגיה מאפשרת כתב בלוציפראז ברזולוציה גבוהה (10-10 דקות) מחקרים של תנודות היממה במשך ימים רבים בהכנת אותו. מחקרים לכן, את מספר בעלי החיים המשמשים ממוזער ומפורט של השפעות על שלב ותקופת קצב הם ריאלי, אשר בדרך כלל אינו אפשרי תוך שימוש בטכניקות דגימה קונבנציונלי עם רזולוציה נמוכה זמן. עם זאת, אף על פי מדידות האמפליטודה היחסית של קצב אפשריים, יש להדגיש כי הטכנולוגיה הכתב אינו כמותי ולכן יכול לא להשתמש כדי למדוד כמויות של גנים או חלבונים עיבד המתורגם. ההקלטות רקמה ניתן להתחיל לנתח מיד לאחר culturing, יתרון גדול עבור ישירות לומד המולקולרי של תופעות של מתח vivo, in vivo אור-Induced משמרות שלב וכו &#39;תרבות SCN organotypic מאפשר לטווח ארוך (שבועות) מניפולציה תרופתי של המוח המבוגר רקמה המכילה מערך שלם הסינפטי בוגרת הטכנולוגיה כתב בלוציפראז מאפשר הקלטות יציבה במשך שבועות רבים. לפיכך, הרקמה לא צריך להיות לאחר הלידה בילוד או מוקדם כדי להשיג תרבויות בריא, בניגוד לטיפולים תרופתיים כרונית חריפה פרוסה יכול להתבצע. בניגוד לכתב פלסמיד-transfections בתרביות תאים, אשר אין לעשות להוביל שילוב של ה-DNA לתוך הגנום, מהונדס בלוציפראז דגמים בעלי חיים (כמו גם lenti וירוס transfections) הם נוחים אם שינויים epigenetic הם להיחקר. ראוי בהקשר זה גם לציין כי הדמיה הארה היא כיום אפשרי עם רגישות גבוהה מצלמות CCD 11, המאפשר הקלטות גם נוירונים SCN יחיד (~ 60-10 מיקרומטר) ואת סוגי תאים אחרים, מנוצל על ידי מעבדות מרכזי לימוד מקצבים היממה. לבסוף, החוקרים היממה כמה נפוץ השימוש ניטור הביטוי מולקולריים באמצעות כתבים אחרים, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק, כדי ללמוד בגן השעון / תנודות חלבון 16-19. היבטים של עובי פרוסת עוביים המליצה פה של הפרוסה SCN (200-300 מיקרומטר) יכול להיות מופחת או מוגבר אם תרצה בכך. עם זאת, למרות רקמת משתטחת על קרום אחרי כמה ימים בתרבות, לא מומלץ לעלות על 500 מיקרומטר עובי של הפרוסה לחתוך תחילה כדי לשמר יכולת הקיום של הרקמה 7. פרוסה דק יותר הוא 100 מיקרומטר סיבות מכניות ומעשי קשה להתמודד. מכיוון רקמת SCN הטרוגנית עובי של הפרוסה עשויים להשפיע על השלב של אות פלט בלוציפראז, שכן אזורים שונים בתוך SCN (למשל את &quot;הליבה&quot; מול &quot;קליפה&quot;, ואזורים הגב לעומת הגחון) להתנדנד עם שלבים שונים 20 ו דיפרנציאלי מחדש לסנכרן לאחר שלב משמרות 21. עובי של הפרוסה משפיע גם על בסיס של פוטון לספור מאז רקמות פולט יותר מספר גדול יותר של פוטונים. המשרעת של תנודות מולקולריות יכול בדרך זו בעקיפין להיות מושפע גודל explant. מסיבות אלה, מלאה תרבויות התייחסו תמיד צריך להיות באותו עובי של גודל, המכילים את אותו אזור של SCN מנת להתנדנד בשלב אותו עם אמפליטודה זהה. שני גרעינים חד צדדית, מצד שני, להתנדנד בשלב אחד עם השני ועם אמפליטודות דומה עוד לחתוך vibratome הוא אופקי ולא זוויתי (אשר בתורו תלוי כי ההפרדה בין המוח הקטן לחתוך את שתי ההמיספרות הוא בניצב על פני השטח טבלה). החוקר אשר מבצע culturing SCN יכול לחוות תרבויות SCN לא להתנדנד בשלב אחד עם השני. תרגול סטנדרטיזציה של הטכניקה חיתוך, כלומר את הפרוסות נחתכות תמיד ברמה rostro-הזנב אותו SCN, תשפר את התוצאה. צעדים קריטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת החמצן הוא קריטי. מכיוון שהמוח דורש הרבה חמצן 22, ההליך חיתוך צריך להיות מהיר (ככל 3.1-3.10 הוא ~ 5-6 דקות זה יותר טוב כדי לשמור על הרקמה הבריאה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה וחילופי בינוני. SCN הוא רגיש לשינויי טמפרטורה הטמפרטורה גדול יכול להסיט את שלב קוצב לב ולגרום ממצאים ניסיוניים 23. אם בינוני או פתרונות מוחלפים או הוסיף במהלך ניסוי מתמשך, למשל כאשר החלים תרופה אחרי כמה ימים בתרבות, הבינוני או solution צריך להיות מחומם מראש ל 36-37 ° C (הטמפרטורה זהה בתא) לפני כן. בניסויים פרמקולוגיים הכוללים חילופי בינוני, חשוב תמיד לעבוד עם מדיום מראש מותנה תרבית תאים. תוספת / לשטוף החוצה עם טרי, בינוני מותנית עלולה שלב משמרת את הקצב SCN מולקולריים 24, כמו גם סוג תא אחר תרבויות 25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הרכב. חשוב בתרבות רקמות pH osmolality הנכונים. בינוני אוויר חציצה מכיל כמות גדולה של HEPES, אשר בעל קיבולת חיץ אופטימלי בטווח של 6.8-8.2 pH ו מתאים גם חציצה השינויים pH שעלולות להתרחש כתוצאה הנשימה בתא. HEPES, מצד שני, הוא רגיש יותר לשינויי טמפרטורה לעומת סודיום ביקרבונט, הכלולה בכמויות קטנות ובינוניות התרבות. סודיום ביקרבונט בעל קיבולת חציצה גדולה יותר ב-pH נמוך יותר (5.1-7.1) טווח 26, המתאימה ובכך באווירה CO 2. עם זאת, כמויות גדולות יותר של סודיום ביקרבונט במדיום אוויר חציצה (DMEM 2902) מגדילה את osmolality משמעותית ולא ניתן להוסיף בו זמנית ללא דילול בינוני, שבתורה גוררת בהרכב נכונה של חומצות אמינו, ויטמינים יונים. עצות להכנת בינוני: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הייה מדויק וזהיר כאשר ערבוב הבינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פתרונות מניות טרי או מופשר רק עתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של osmolality גבוהה מאוד זה לא שווה דילול. יותר מ 5-6%, בדילול בינוני סביר להניח שלא לעבוד. שימוש D-גלוקוז להגדיל osmolality אם היא נמוכה מדי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב משמרות עקב זמן ההכנה זמן הכנה פרוסה היא קריטית. השפעה מינימלית על אפס או שלב מתקבל אם ההליך פרוסה מתבצע בין ZT דצמבר 06-12. והניתוחים כל פרוסה צריכה להתבצע בשלב זהה של מחזור יומי או היממה כדי למזער שגיאות עקב וריאציה בין שלב ההכנות. </li></ol> שינויים אפשריים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור electrophysiology SCN חריפה, החיתוך צריך להתבצע עם Ringer (מלאכותית נוזל השדרה Cerebro; ACSF) חוצץ, רווי חמצן (95% O 2, 5% CO 2) לפני תחילת חיתוך. יתר על כן, חמצן צריך להוסיף ברציפות למאגר במהלך ההליך כולו חיתוך, כמו הפעילות החשמלית הסינפטי תלויה ישירות על אספקת חמצן 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות אופקי sagittal יכול גם להיות מוכנים בהצלחה תרבותי של SCN. המחברים יש ניסיון עם הקלטות בלוציפראז ב פרוסות אופקיות, אשר על פי הניסיון שלנו לתת תנודות היממה עם משרעת נמוכה יותר בהשוואה לחתוך את העטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SCN הוא כ 1 מ&quot;מ ארוך rostro-caudally ואת טכניקת חיתוך המתואר כאן הוא ממוקד כלפי רכישת סעיף SCN באזור המרכז. עם זאת, אחד או יותר סעיף SCN ניתן להשיג עכבר מוח החולדה, המאפשר חקירה של ביטוי גנים / חלבונים היממה ברמות מקורי יותר מול הזנב של הגרעין SCN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Slice מבעלי חיים הצעיר, הגורים לאחר הלידה, או אפילו עוברים, יכול גם להיות מוכנים. שים לב המוח לגולגולת גורים צעירים מאוד רכים מאוד רגיש. בנוסף, עצב הראייה הוא דק ולא מפותחת. קח זהירות בעת לנתח את המוח של הגורים כל כך את האזור SCN אינו פגום. למשל, מיקרו כלים rongeur לא ניתן להשתמש כדי לפתוח את הגולגולת של גורים העכבר כי הם גדולים מדי. מספריים פיין הם מספיק כדי לחתוך את הרקמות הרכות של גורים צעירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזכוכית המכסה טכניקה המבוססת תרבות המתואר כאן יכול לשמש גם כדי הארה תמונה באמצעות מצלמה CCD / EM-CCD, גם בנוירונים SCN יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזורים אחרים של מערכת העצבים המרכזית ורקמות איברים מן הפריפריה מהונדס PER2:: בעלי חיים לוק יכול בקלות לקבל, תרבותי ניתח במונחים של תנודות מולקולריות, כמו PER2: הביטוי לוק ממשיך להתנדנד במשך ימים רבים גם במספר רקמות אחרות תא 10 סוגים. רוב אלה ברקמות הפריפריה, על הכבד, למשל, אינם דורשים קרום להישרדות אך במקום מתורבת טובל ישירות 11 בינוני. שים לב כי בשלב הסטה עקב חתך, culturing וחילופי בינוני לא יכול לעקוב אחר אותם עקרונות כמו SCN. </li></ol> משמעות בשנת עכבר מהונדס ועל זני חולדה (mPER2: לוק; mPer1 לוק 8, 10, 27) פעילות האנזים בלוציפראז משקף חלבון או ביטוי גנים מקצבים ניתן להעריך על ידי הקלטה פליטת אור. פליטת אור בלוציפראז שנוצר נותן אות חלש אבל הארה הרקע הוא קרוב לאפס, מה שהופך שיטה זו יתרון. יתר על כן, כי המולקולה אינה יציבה בלוציפראז ו מושפל במהירות יש ph לאototoxicity, אשר יכול להופיע במהלך תאורה לטווח ארוך מעורר 28. יחדיו, תכונות אלו מאפשרות לטווח ארוך ביצוע ניסויים בטכנולוגיה כתב בלוציפראז יתרון מאוד במחקר היממה.

<table><tbody><tr><td>תוסף B27 בריכוז 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>Menzel-Glaser</td><td>40#1</td><td>&amp;#8776; 40 mm</td></tr><tr><td>ממברנות תרבית</td><td>EMD Millipore</td><td>PICMORG50</td><td>0.4 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>DMEM עם רמת גלוקוז נמוכה ללא פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2902</td><td>אבקה ל-1L</td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1003 055</td><td>&amp;#8776; 55 mm</td></tr><tr><td>ערכת סינון</td><td>Corning</td><td>431097</td><td>גודל נקבים 0.22 &amp;#x03BC;mPolyethersulfone</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>0203-7-PS</td><td>Dumant #7</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>Invitrogen</td><td>14065-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>NaOCH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 7.5%</td><td>Invitrogen</td><td>25080-060</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>לוסיפרין</td><td>Promega Corp.</td><td>E1602</td><td>לוסיפרין מחיפשית, מלח אשלגן</td></tr><tr><td>כלי רונגור (rongeur) מיקרוסקופי</td><td>Allgaier Instrumente</td><td>332-097-140</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep 10,000 U/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>&amp;#8776; 35 mm</td></tr><tr><td>PMT</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H9319-11MOD</td><td></td></tr><tr><td>סקלפלים חד-פעמיים</td><td>Paragon</td><td>P503</td><td>גודל 11</td></tr><tr><td>מסנן ואקום</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-5</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>50 g</td></tr><tr><td>ויברטום (Vibratome)</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

השעון הביולוגי המרכזי (~ 24 שעות) תיאום מקצבים יומיים פיסיולוגיה והתנהגות מתגורר גרעין suprachiasmatic (SCN) הממוקם בהיפותלמוס הקדמי. השעון מסונכרן ישירות על ידי אור דרך הרשתית ועצב הראייה. תנודות היממה מופקים על ידי אינטראקציה לולאות משוב שלילי של מספר &quot;גנים של השעון&quot; מה שנקרא מוצרי החלבון שלהם, כולל התקופה (פר) גנים. השעון הליבה תלוי גם שלילת קוטביות הממברנה, סידן cAMP 1. SCN מראה תנודות יומי בביטוי שעון הגן, פעילות מטבולית לבין פעילות חשמלית ספונטנית. למרבה הפלא, זו פעילות מחזורית אנדוגני נמשכת פרוסות הרקמה הבוגרת SCN 2-4. בדרך זו, השעון הביולוגי יכול בקלות להיות למד במבחנה, המאפשר חקירות מולקולרית, אלקטרו ומטבוליים של פונקציית קוצב לב. SCN הוא קטן, מוגדר היטב מבנה דו ממוקם ממש מעל התצלובת האופטית 5. בשנת החולדה היא מכילה ~ 8.000 נוירונים בגרעין כל יש ממדים של כ 947 מיקרומטר (אורך ציר rostrocaudal) x 424 מיקרומטר (רוחב) x 390 מיקרומטר (גובה) 6. כדי לנתח את SCN יש צורך לחתוך פרוסת המוח ברמה מסוימת של המוח שבו ניתן לזהות SCN. כאן, אנו מתארים את הליך הניתוח, חיתוך של SCN, אשר דומה העכבר מוחות העכברים. יתר על כן, אנו מראים כיצד תרבות רקמות גזור organotypically על קרום 7, טכניקה שפותחה על ידי התרבות רקמת SCN ימזאקי et al. 8. לבסוף, אנו מדגימים כיצד רקמה מהונדס יכול לשמש למדידת ביטוי של גנים של השעון / חלבונים באמצעות כתב דינמי טכנולוגיה בלוציפראז, שיטה במקור שימש למדידות היממה על ידי Geusz et al. 9. אנחנו כאן להשתמש ברקמות SCN מן מהונדס עקום ב PERIOD2: עכברים בלוציפראז המיוצר על ידי יו ואח&#39; 10.. העכברים מכילים חלבון היתוך תקופה (PER) 2 ו בלוציפראז אנזים הגחלילית. כאשר PER2 מתורגם בנוכחות המצע עבור בלוציפראז, כלומר luciferin, הביטוי PER2 ניתן לנטר כמו פליטת אור כאשר בלוציפראז מזרז חמצון של luciferin. מספר הפוטונים הנפלטים חיובי בקורלציה לכמות חלבון המיוצר PER2, לבין מקצבים פליטת אור להתאים את קצב חלבון PER2 in vivo 10. בדרך זו וריאציה מחזורית בביטוי PER2 ניתן לפקח באופן רציף בזמן אמת במהלך ימים רבים. הפרוטוקול אנו עוקבים עבור culturing רקמות בזמן אמת, הקלטה פליטת אור תוארה באופן יסודי על ידי ימזאקי ו טקהאשי 11.

הליך של הכנת פרוסות המכיל את עכבר מבוגר ההיפותלמוס גרעין suprachiasmatic (SCN), ודרך מהירה לתרבות רקמת SCN במצב תרבות organotypic, הם דיווחו. יתר על כן, במדידה של הגן oscillatory ביטוי חלבון שעון דינאמי באמצעות כתב הטכנולוגיה בלוציפראז מתואר.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

שעון צירקדי מרכזי (~24 שעות), המתאם מקצבים יומיים בפיזיולוגיה ובהתנהגות, שוכן בגרעין העל-כיאסמטי (SCN) הממוקם ב...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים כיצד לבצע חיתוך ודיסקציה של הגרעין על-הכיאסמטי (suprachiasmatic nucleus) מעכברים טרנסגניים, וכיצד לגדל את רקמת הגרעין במטרה לתעד ביטוי של גן או חלבון שעון באמצעות לומניסנציה המושרה על ידי לוסיפראז. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של המוח מעכבר טרנסגני המכיל רפורטר לוסיפראז עבור גן או חלבון שעון, ולאחר מכן ביצוע חיתוך של המוח המכיל את הגרעין על-הכיאסמטי. השלב השני של ההליך הוא ביצוע דיסקציה של הגרעינים על-הכיאסמטיים הבילטרליים הקטנים מתוך הפרוסה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא גידול של ה-schematic nucleus explan על ממברנה בצלחת פטרי המכילה תוצר תרבית, מצע גידול ולוסיפרין. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא תיעוד פעילות הלוסיפראז על ידי מדידת ביולומינצנציה באמצעות שפופרות מכפיל פוטונים בתא מחומם ואטום לאור. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות תנודה צירקדית של גן השעון או של החלבון.שמי הוא Sergey IV ואני עובד ב-Gabrielle Re Club. שמי הוא SoFi Johansson ואני עובדת בצוות של Gabriella. שמי הוא Gabriel Quist.אני חוקר ראשי במחלקה למדעי המוח, ושמי הוא Ka LaShon, ואני סטודנט לדוקטורט במרכז השוודי למדעי המוח הרפואיים, ואני משתף פעולה עם Gabriella. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו Western Blot, RT-PCR והיברידיזציה באתרים (in situ hybridization) הוא שניתן לעקוב באופן רציף במשך ימים רבים אחר ביטוי של גן או חלבון של השעון הביולוגי באותה רקמה ברזולוציה גבוהה מאוד של כדקה אחת, מה שמאפשר ניתוח מפורט של המחזוריות, האמפליטודה והמופע של המקצב הצירקדי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון ששלבי הפריסה והניתוח של ה-SCN קשים ללמידה.ה-SEN קטן מאוד ועלול להיות קשה לזיהוי. את הפרוצדורה תדגים ד"ר Sge Velia, פוסט-דוקטורנטית בצוות המחקר שלי. לאחר הכנת התמיסות הדרושות, הכינו את צלחות הפטרי שבהן ייעשה שימוש בניסוי באמצעות מזרק של 5 mL ממולא מראש בגריז ואקום לאוטוקלאב.מרחו את הגריז על פני השטח של הטבעת העליונה של צלחת פטרי בנפח 35 מילימטר. הכינו צלחת פטרי נפרדת עבור כל פרוסה של תרבית. מלאו מבחנה מסוג Falcon ב-10 מיליליטר של מצע גידול מאוורר ומבופר.כמות זו תספיק להכנת מצע לשמונה תרביות. הוסף 10 µL של luciferian שהופשר acabado. ה-luciferian רגיש לאור, לכן הגן על מצע ה-luciferian מפני אור על ידי אחסון שפופרת ה-Falcon בתא חימום חשוך בטמפרטורה של 37 °C.בשלב הבא, עקרו את כל המכשירים, את זכוכיות הכיסוי וחומרים אחרים שייעשה בהם שימוש בפרוצדורה. רססו את כל הציוד שאינו סטרילי ב-70% ethanol. חשפו את המכשירים ואת צלחות הפטרי המשומנות ל-UV בתוך מנדף סטרילי למשך 30 דקות לפחות.שלב הכנה נוסף הוא הגדרת מכשיר הוויברטום והרכבת להב תער סטרילי. הציוד כעת מוכן להליך הכירורגי. לאחר הרדמה ועריפת ראש של עכבר, הוצא את העיניים מהראש באמצעות מספריים.פעולה זו מונעת אימון או עירור של העצבים האופטיים, דבר המסייע במניעת נזק לגרעין הסוprכיאסמטי או ל-SCN. השתמש במספריים עדינים כדי להסיר את החוליה הצווארית האחרונה ואת העור. בצע שני חיתוכים בעצם הגולגולת לאורך שני צדי הגולגולת, כך שייווצר מכסה שניתן להסרה.פתחו את הגולגולת באמצעות כלי micro Ron Jre. השתמשו ב-RJ בתנועה כלפי מעלה, ולעולם אל תלחצו עם הכלי על המוח. כדי למנוע נזק ל-SCN העוברי, הסירו את כל העצם עד שניתן יהיה לראות את הפקעות הריח (olfactory bulbs).השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה עדינים כדי לחתוך בזהירות את העצב האופטי בין ההמיספריות לבין הבצלים הריחניים. מקמו צלחת פטרי מלאה ב-50 עד 100 milliliters של HBSS קר תחת ראשו של העכבר. הפכו את הראש והניחו למוח השלם להתחיל להחליק החוצה.חתכו עצבים קרניאליים אחרים לפי הצורך בצד הנגדי לעצב האופטי. כאשר המוח מנותק, הוא נופל אל תוך צלחת הפטרי, דבר המקרר את המוח במהירות. השתמשו בכף כדי להעביר את המוח הקר מאוד למשטח חיתוך סטרילי, כגון מכסה של צלחת פטרי מזכוכית ההופך על פניו.הסר את המוזילום (cerebellum) באמצעות חיתוך בניצב עם להבי תער סטריליים בין ההמיספרים לבין המוזילום. מרח דבק מהיר (superglue) על הפלטפורמה היבשה של ה-viome. הכנס פינצטה עקומה וחדה לחלק הרוסטרלי של המוח והרם את המוח תוך כדי החזקתו באמצעות הפינצטה.ייבשו בזהירות את ה-HBSS בעזרת נייר סינון סטרילי. קבעו את ההמיספרים (hemispheres) על הדבק שבפלטפורמה, כאשר הקצה הרוסטרלי (rostral tip) פונה כלפי מעלה והמשטח הוונטרלי (ventral surface) קרוב ככל הניתן ללהב החיתוך. הצמידו את הפלטפורמה למחזיק הוויברטום ומלאו אותה מיד ב-HBSS קר.אם החיתוך הניצב בוצע כראוי, חצאי הכדור אמורים לעמוד זקוף. המטרה היא לחתוך פרוסות קורונליות הכוללות את האזור המרכזי של ה-SCN הדו-צדדי, תוך שימוש במהירות המקסימלית של הוויברטום. התחילו בחיתוך של מקטעים בעובי 500 עד 800 micrometer מחצאי הכדור עד להגעה לקומיסורה. צפייה.ככל שהכיאזמה האופטית (optic chiasm) מתרחבת, בליווי הפחתת עובי החתכים ל-100 micrometer, המשיכו לחתוך לכיוון הגב (caudal direction), תוך הגברת השליטה בהנעה הידנית האופקית של הלהב עד להופעת שני גרעיני ה-SCN. השתמשו בזכוכית מגדלת במידת הצורך כדי להבחין בגרעינים עם ההגעה למפלס ה-SCN. חתכו נתח SCN בעובי של 250 micrometers.מלאו מכסה של צלחת פטרי בגודל בינוני ב-HBSS קר בעזרת מברשת רכה. הרימו והעבירו את חיתוך המוח של ה-SCN אל צלחת הפטרי. הניחו את צלחת הפטרי תחת מיקרוסקופ דיסקסקציה.השלב הבא הוא להוציא את ה-SCN מהפרוסה. השתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שה-SCN הבילטרלי נראה בבירור לפחות בצד אחד של החתך. השתמשו בזוג סקלפלים סטריליים כדי לחתוך ריבוע של רקמה, ברוחב של כ-1.5 millimeters לכל צד, המכיל את שני ה-SCNs.בצעו חיתוך קרוב ככל האפשר ל-SCN. ללא הסרה של רקמת SCN, יש לצרף חתיכה קטנה של העצב האופטי ל-explan, אך אין לכלול גרעינים אחרים. חתכו את הרקמה המכילה את ה-SCN הדו-צדדי לחצי כדי לקבל שני SCNs חד-צדדיים.ניתן להשתמש ב-SCN חד-צדדי אחד כביקורת במנדף סטרילי. כאשר האור כבוי, הוסף 1200 microliters של תוצר Lucifer לצלחת פטרי בקוטר 35 millimeter, ולאחר מכן הנח ממברנת תרבית על פני השטח של הנוזל. וודא שאין בועות אוויר מתחת לממברנה.השתלים זעירים וקשה לאסוף אותם. לכן, השתמשו בפיפט של 1000 microliter עם טיפ כדי לשאוב את ה-SEN explan אל תוך הטיפ ולהוציא אותו על ממברנת התרבית. השליכו את עודפי ה-HBSS עבור הקלטת לוסיפראז והניחו SEN אחד בלבד בכל צלחת פטרי.אטמו את צלחת הפטרי עם הגריז באמצעות זכוכית כיסוי בקוטר 40 מילימטר. הוסיפו גריז במידת הצורך אם האיטום אינו הדוק. העבירו את צלחות הפטרי למכשיר aluma cycle הממוקם בתא חימום אטום לאור בטמפרטורה של 36 עד 37 °C.כדי להתחיל בגידול, שימו לב לכלי הגידול ולהרכבות גלאי צינורות הכפלה פוטו-אלקטרית המותקנות בתוך תא מחזור התאורה. מקמו את כלי הגידול מתחת לצינורות הכפלה הפוטו-אלקטרית במרחק של כ-1 עד 2 סנטימטרים. צינורות הכפלה הפוטו-אלקטרית מזהים ומגבירים את הלוסיפראז המושרה על ידי לומניסנציה.כלי התוכנה Luma Cycle משמש לרכישת נתונים. ספירות הפוטונים נסכמות על פני מרווחי זמן של דקה אחת עד 10 דקות כדי לקבל רזולוציה גבוהה של ביטוי חלבון הגן. הביטוי הציקדי של חלבון הגן מנותח כדי לקבוע את הפאזה, התקופה והאמפליטודה של המקצב.איור זה מציג רישומים של ביולומינצנציה מתרביות רקמה של SCN בריאות ולא בריאות. עכברים אלו הוחזקו ב-12 שעות אור ו-12 שעות חושך לפני הסרת רקמת ה-SCN שלהם. הקו השחור מציג את המקצב הצירקדי של רישומי הביולומינצנציה של ביטוי לוציפרז מסוג period two.בפרוסה בריאה של SEN, החלב תנוד בשינוי צירקדי שבו הביטוי המקסימלי של החלב מתרחש בזמן ze gaber, 12 עד 13 או בראשית החשיכה. לכן, המופע (phase) של מקצב הגן תלוי בלוח זמני האור והחושך שבו שהה בעל החיים לפני ההקרבה. הקו הכחול מראה הקלטות ביו-לומינסנציה מ-SE ומתרבית שהתייבשה לאחר שצלחת התרבית נפתחה ביום הרביעי, כפי שמצוין על ידי החץ, ולא נסגרה כראוי.הקו האדום מציג רישומי ביולומינצנציה מתרבית SCN שאינה בריאה. איור זה משתמש בתרבית SCN בניסוי פרמקולוגי. האיור מציג עקבה מתרבית שטופלה בחוסם תעלות יונים מסוג HCN במועד המצוין על ידי החץ הראשון.במהלך יומיים עד שלושה ימים, חוסם תעלות היונים הפחית ולאחר מכן עצר את התנודה הצירקדית בחץ השני. התרופה נשטפה והוחלפה במצע בקרה מותנה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעבוד במהירות אך בזהירות כדי לשמור על חיות רקמת ה-SEN.חשוב גם להנפיק סטנדרטיזציה לחיתוכי ה-vibram שלך כדי להבטיח שכל פעם תתקבל אותה רמה של ה-SEN. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן החיתוך והניתוח של תרבית ה-SEN, של איבר ה-SCN, בדרך כלל על ממברנה, וכיצד לנטר ביטוי של גנים או חלבונים של השעון הביולוגי כלוסיפרז המושרה על ידי לומניסנציה בתרביות.

slice-preparation-organotypic-tissue-culturing-luciferase-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זהו פרוטוקול להכין ולתחזק הכנה פרוסה neocortical בתרבות organotypic לצורך ביצוע הקלטות חשמל עצב פירמידליים.

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

שעוני יממה לתפקד בתוך תאים בודדים, כלומר, הם תאים אוטונומיים. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת מודלי שעון תא אוטונומי באמצעות טכנולוגיה לא פולשנית, לוציפראז מבוסס זמן אמת פליטת אור. תאי Reporter מספקים מערכות צייתניות, פונקציונליות מודל ללימוד ביולוגית יממה.

ניטור מקצבי Cell-אוטונומי יממת שעון של ביטוי גנים באמצעות כתבי פליטת האור לוציפראז

מקור: Sabado, V..,  et al., Nagoshi, E. הדמיה חיה פלואורסצנטית ברזולוציה של תא בודד של }Drosophila שעונים צירקדיים במוח הזחל תרבות. J. Vis. exp. (2018).  } סרטון זה מדגים את ההליך להטמעת המוח }{{}}} במטריצת פיברין, ואחריו הדמיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר של תאי עצב בשעון הביולוגי כדי לנתח פעילות קצבית המסונכרנת עם מחזורי אור/חושך.

הטמעת מוח דרוזופילה במטריצה להדמיית זמן-lapse של נוירוני השעון הביולוגי

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

טכנולוגיה זו מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית פיתח ' מאפשר ניטור לטווח ארוך של שעתוק של גנים שעון היממה העל-תצלובתי (SCN) לנוע בחופשיות עכברים בזמן אמת, ברזולוציה הטמפורלית גבוהה.

אין ויוו פיקוח על ביטוי גנים שעון היממה בתצלובתי העכבר באמצעות קרינה פלואורסצנטית כתבים

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור שמחוץ דרוזופילה המוח זחל תרבות בצורה מיטבית כדי לפקח על היממה מולקולרית מקצבים עם הדמיה בצילום מואץ לטווח ארוך של זריחה. היישום של שיטה זו מבחני תרופתי גם נדון.

קרינה פלואורסצנטית תא בודד רזולוציה לחיות הדמיה של שעונים היממה דרוזופילה בתרבות המוח זחל

תאי גזע/מחולל קדמון מציגים דינמיקה של ביטויים שונים של רכיבי איתות מדרגה שמובילים לתוצאות שונות של אירועי הסלולר. ביטוי דינמי כזה יכול להתגלות על ידי ניטור בזמן אמת, לא על ידי ניתוח סטטי, באמצעות מערכת הדמיה ביולומינציה רגישה מאוד המאפשרת ויזואליזציה של שינויים מהירים בביטויי גנים.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

דוח זה מתאר שיטה הכוללת סקריפט R בתוכנת הקוד הפתוח RStudio לניתוח מערכי נתונים בקנה מידה גדול המתקבלים מניסויים בסדרות זמן.

ניתוח R ידידותי ועוצמתי של מערכי נתונים בקנה מידה גדול

למדו הכנת פרוסות מגרעין suprachiasmatic בעכברים טרנסגניים וגידול רקמות אורגנוטיפי עם הקלטת לוציפראז. שיטה זו מאפשרת מעקב רציף אחרי ביטוי גני השעון ביולוגי ברזולוציה גבוהה.

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

גלה סרטונים נוספים