הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט
10 בפברואר 2011
Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתעד פעילות פוסט-סינפטית בסינפסות הנכנסות של תאי השיער הפנימיים. זה מושג על ידי חשיפת האפיתל החושי של שבלול שהוסר לאחרונה מחולדה ערופת ראש. השלב השני של ההליך הוא למקם את האפיקל הכרות, להפעיל פתק כיסוי שונה ולהעבירו לתא ההקלטה.
השלב השלישי של ההליך הוא איתור וקבלת גישה לשרביט נכנס עם אלקטרודת הקלטה. השלב האחרון של ההליך הוא ליצור אטימה הדוקה ולאחר מכן לקרוע את קרום הסיבים הנכנסים, תוך יצירת תצורת התא השלמה של טכניקת מהדק התיקון. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות התרחשות פוסט-סינפטית או פוטנציאלים מסינפסה של סרט בודד דרך אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תא שלם.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את החיתוך וההכנה של רקמת השבלול וקשה לזהות את הסיבים הקטנים הנכנסים ולגשת אליהם. לפני תחילת הדיסקציה, הכינו פתק כיסוי שונה שיחזיק את התכשיר במקומו במהלך ההקלטות. בעזרת החלקת כיסוי זכוכית עגולה של שמונה עד 12 מילימטרים, מרחו טיפה של מגן סיל חצי מרפא לכיוון קצה החלקת הכיסוי.
הנח את הקצה העבה של סיכת חרקים עדינה על החלקת הכיסוי. החזק את סיכת החרק בחוזקה כנגד הזכוכית. בעזרת מלקחיים, מחממים את מגן האדן כנגד סליל מחומם להתייצבות.
הכן 10 עד 20 מיקרו אלקטרודות כמתואר בטקסט הנלווה. לאחר ליטוש אש עם מיקרו זיוף, המיקרו אלקטרודה צריכה להיות בקוטר קצה חיצוני של כמיקרון אחד. העובי הסופי של דופן הפיפטה שווה לכשליש מיקרומטר לאחר הרדמה ועריפת ראש של חולדה בת שלושה שבועות.
התחל את הדיסקציה על ידי הסרת העור בי ניתוח הראש והסרת המוח כדי לחשוף את העצם הטמפורלית, הסר את שתי העצמות הטמפורליות. מניחים כל עצם טמפורלית בכלי חיתוך נקי המכיל תמיסה חוץ-תאית סטנדרטית. השלב הבא הוא הסרת העצם, עטיפת העצם הטמפורלית, כדי לחשוף את השבלול.
החזק את העצם הטמפורלית היטב בבסיס בעזרת זוג מלקחיים. זהה את החלון העגול והסגלגל ואת השבלול. כוון את השבלול כך שהחלון הסגלגל והצד הספירלי של השבלול פונים כלפי מעלה.
הסר עודפי עצם סביב השבלול. השתמש בזוג שני של מלקחיים עדינים כדי לשבור את העצם ישירות מהשבלול, החל מהאזור השקוף יותר משאר העצם. כאן העצם דקה יותר וקלה יותר להסרה.
המשך להסיר את העצם מסביב לסליל האפיקלי. השתמש במספריים לניתוח מיקרוס כדי לחתוך את המודיס מתחת לסיבוב האפיקלי. ואז נתק את הסיבוב האפיקלי מהסיבובים התחתונים של השבלול.
הקפד להגן על הסליל האפיקלי. אסור למשוך או למתוח אותו. לבסוף, הסר את הסיבוב האפיקלי מהשבלול מבלי לקרוע את הרקמה יותר מדי.
השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר את שאר העצם. השלב הבא הוא הסרת ה-STR של ה-oculis והקרום הטיאלי. הסר בזהירות את ה-STR של oculis, רצועת הרקמה המבריקה הממוקמת מחוץ לאזור תאי השערה.
הקפד להימנע מהסרת תאי השיער התחושתיים, שיכולים להתנתק בקלות יחד עם ה-STR של האוקוליס. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את קרום הטיאל. הממברנה השקופה למחצה המבריקה שיושבת מעל תאי השיער החושיים קוצצת כעת רקמות ועצם עודפות ומשטחת את התכשיר בעזרת המלקחיים.
זה הכרחי כדי שניתן יהיה למקם את הרקמה באופן שווה מתחת לסיכה. הנתיחה הסתיימה כעת. הניחו את התכשיר מתחת לסיכה על החלקת הכיסוי המוכנה והקפידו למקם את הסיכה הרחק מתאי השיער לאחר השלמת החיתוך.
השתמש במלקחיים כדי להעביר את התכשיר לתא ההקלטה תוך שמירה על טיפת נוזל חוץ-תאי על החלקת הכיסוי המחזיקה את רקמת השבלול התחל מיד בשפע עם תמיסה חוץ-תאית. כדי להבטיח הישרדות טובה יותר של התכשיר, השתמש במטרת 10x של המיקרוסקופ או במטרת ה-DIC של טבילה במים פי 40. כדי לאתר את התכשיר, כוונו את התכשיר כך שאלקטרודות ההקלטה יוכלו להתקרב לתאי השערה הפנימיים בזווית ישרה לדפנות הצדדיות שלהם.
אם הנראות של אזור הבסיס של תאי השיער הפנימיים מוגבלת מכיוון שהתכשיר מסולסל, השתמש באלקטרודת הקלטה כדי לדחוף את הקצה החיצוני של התכשיר כלפי מטה כנגד החלקת מכסה הזכוכית. הקפד להימנע מלחיצה על תאי השערה הפנימיים עצמם. בתכשיר זה, האלקטרודה העליונה מחזיקה את הקצה החיצוני של התכשיר במורד סימני האלקטרודה התחתונים שבהם ממוקמות האלות הנכנסות.
לעיון, מצלמת NC 70 Nuv Con מציגה את התמונה המוגדלת במט"ח על הצג כדי להעריך אם הרקמה באזור תאי השיער הפנימיים בריאה. מצא את צרורות השיער כנקודת התייחסות והתמקד למטה כדי למצוא את הגרעינים. התמקד למטה יותר לכיוון בסיס תאי השערה הפנימיים עם הקצוות הנכנסים שלו וחזרה למעלה עד שתגיע לרמת הגרעינים במוניטור.
כעת אתר את האלות הנכנסות סביב בסיס תאי השיער הפנימיים. אלות כדוריות או אליפסואידיות, בקוטר של מיקרון אחד בערך וצבען בהיר עם מראה מבריק. תוכלו למצוא אותם על ידי התמקדות למעלה ולמטה.
השלב הבא הוא לפנות נתיב לסיבים הנכנסים באמצעות אלקטרודת הקלטה עם קצה מיקרון אחד מלא בתמיסה תוך תאית. הפעל לחץ חיובי והשתמש במניפולטור המיקרו כדי לתמרן את האלקטרודה לתכשיר. השתמש באלקטרודה זו כדי לבצע חתך בתכשיר בגובה בסיס תאי השיער הפנימי.
דחפו את האלקטרודה בין השכבה הדקה של התאים התומכים לתאי השערה הפנימיים באמצעות לחץ חיובי כדי ליצור נתיב גישה לאזור בבסיס תאי השערה הפנימיים. הסר בזהירות את האלקטרודה והחלף אותה באלקטרודה טרייה עם קצה בקוטר מיקרון מלא בתמיסה תוך-תאית. השתמש בלחץ חיובי כדי לשמור על קצה אלקטרודה נקי, הזז את אלקטרודת ההקלטה דרך חור הגישה סביב תאים תומכים סמוכים לכיוון השרביט הנכנס.
ודא שקצה האלקטרודה נמצא ישירות מול אלות השרביט הנכנסות מציעות עמידות רבה יותר לתנועת הפיפטה מאשר התאים התומכים וקרום תאי השיער הפנימי. ניתן להרגיש את ההבדל הזה כאשר מזיזים את הפיפטה, להזיז את הפיפטה למעלה ולמטה ולדחוף כדי לוודא שהבוטון זז. זה מצביע על כך שקצה הפיפטה והבוטון נמצאים באותו מישור מיקוד כאשר האלקטרודה נלחצת על הבוטון הנכנס בו זמנית לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל יניקה ליצירת איטום ג'יגה אוהם.
החל פרצי יניקה עדינים כדי לקרוע את הממברנה בתוך האלקטרודה כדי לקבל הקלטת תא שלם. אם התא המתוקן, הוא שרביט אפרנטי, נצפים ארעיים קיבוליים קטנים במצב הקלטת התא כולו. איור זה מציג חולף טיפוסי שנרשם מסיב אפרנטי.
התחל לתעד פעילות סינפטית. אם הסיב הנכנס אינו מפגין פעילות ספונטנית, יש לבצע דה-פולריזציה של תא השיער על ידי מריחת תמיסה חוץ-תאית עם ריכוז אשלגן גבוה יותר. איור זה מציג יחסי מתח זרם אופייניים עבור סיבי AFF משמאל ותאי השערה הפנימיים מימין.
יחסי המתח הנוכחיים נרשמו פוטנציאל החזקה של מינוס 84 מילי-וולט עם צעדי מתח ממינוס 124 מילי-וולט ל-36 מילי-וולט חיוביים במרווחים של 10 מילי-וולט. מתחים מוצגים מימין לכמה עקבות המתמקדים ביחסי המתח הנוכחי מסיב אפרנטי. שימו לב שההתרחשות הפוסט-סינפטית המעוררת או EPCs קיימים ברוב שלבי המתח.
ה-EPCs הפכו חיובי בכ-6 מילי-וולט חיוביים. הקלטה זו בוצעה בנוכחות טטרה לרעלן כדי לחסום זרמי נתרן מגודרים במתח ללא החוסם זרמי נתרן מפעילים במהירות פנימה היו מופיעים בנוסף בהקלטה וזיהו את ההקלטה כהקלטת סיבים אפרנטיים. שימו לב, הזרם הנכנס המופעל לאט במתחים היפרפולריזציה.
זרם זה אינו קיים בתאי השערה הפנימיים או בתאים תומכים ומספק אינדיקציה טובה לכך שהרישום הוא מסיב אפרנטי. הקלטות אלה מראות את יחסי המתח הנוכחיים עבור תא שיער פנימי. החץ מצביע על זרמי אשלגן המפעילים במהירות כלפי חוץ בפוטנציאלים חיוביים.
אחריהם זרמי אשלגן מיישר מושהים עקב קוטר פיפטה צר והתנגדות גישה גבוהה. זרמי תאי השערה הפנימיים המוצגים כאן קטנים מהצפוי כדי לקבל רישומים מדויקים של זרמי תאי השערה הפנימיים. יש להשתמש בפיפטות עם התנגדות גישה נמוכה יותר.
עם זאת, ההקלטות המוצגות כאן מדגימות כי ניתן להבחין בבירור ביחסי המתח הנוכחיים של תאי השערה הפנימיים והסיבים הנכנסים. איור זה מציג זרמים סינפטיים שנרשמו מסיב אפרנטי. שימו לב לגודל ולצורה המשתנים של ה-EPC.
ההקלטות נעשו בטמפרטורת החדר עם טטרה טואין מופעל כדי לחסום את זרמי הנתרן המגודרים במתח. איור זה מציג הקלטות סימולטניות מתא שיער פנימי ושרביט מגע. שלב מתח שימש לדה-פולריזציה של תא השערה הפנימי ובתגובה נרשמו זרמי סידן פנימה מתא השערה הפנימי, זרם הסידן מביא לשחרור נוירוטרנסמיטרים והפעלת EPCs בשרביט הנכנס.
שימו לב, השקע הסינפטי המופיע במהלך דפולריזציה של תאי שיער פנימיים של 50 אלפיות השנייה תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב לזכור להקפיד על ניתוח והכנת רקמת שבלול ולהישאר סבלניים ואופטימיים כאשר מנסים להקליט מהטרמינלים הנכנסים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה להקלטות patch-clamp של תא שלם (whole-cell) מדנדריטים של סיבי עצב שמיעתי בסינפסת הסרט (ribbon synapse) של תאי השערה הפנימיים בשבלול של יונקים. שיטה זו נועדה ללכוד פעילות פוסט-סינפטית בסינפסות אפרנטיות, ובכך לספק תובנות לגבי עיבוד שמיעתי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של השמיעה
רקע
- טכניקת patch-clamp של תא שלם היא חיונית לחקר התמסורת הסינפטית.
- הסינפסה הסרטית (ribbon synapse) של תאי השערה הפנימיים ממלאת תפקיד מרכזי בעיבוד אותות שמיעתיים.
- גישה לסיבים אפרנטיים קטנים היא מאתגרת מבחינה טכנית.
- הדגמה חזותית מסייעת בהבנת הדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול.
מטרת המחקר
- להקליט פעילות פוסט-סינפטית בסינפסות אפרנטיות של תאי שערה פנימיים.
- להדגים את טכניקת ה-whole-cell patch-clamp במודל של יונקים.
- להקל על למידת הדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרידה של רקמת השבלול מחולדה לאחר decapitation.
- הכנה של זכוכית כיסוי משופרת לייצוב הרקמה.
- שימוש במיקרו-אלקטרודות להגעה לסיבים האפרנטיים.
- הקלטות whole-cell patch-clamp למדידת פעילות סינפטית.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של קונפיגורציית תא שלם (whole-cell) בסינפסה של תא שיער פנימי.
- הקלטה של פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מסינפסות סרט (ribbon synapses) בודדות.
- הדגמה של יעילות השיטה בלי captured של פעילות סינפטית.
- עזרים חזותיים שיפרו את ההבנה של תהליך הדיסקציה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה מהימנה לחקר סינפסות שמיעתיות.
- התובנות שיירכשו עשויות לתרום להבנת מנגנוני עיבוד שמיעתי.
- הדגמות חזותיות הן חיוניות לשליטה בטכניקה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בחינה אלקטרופיזיולוגית ישירה של סינפסות סרט (ribbon synapses) בודדות, ומספקת פלטפורמה ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקת שחרור המוליכים העצביים במערכות חושיות. באמצעות לכידה של זרמים פוסט-סינפטיים מסיבים אפרנטיים בודדים接 contacting תאי שיער פנימיים, הגישה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מודלים של תמסורת סינפטית הרלוונטיים לתיקוף מטרות במדעי המוח. הטכניקה מציעה ערך ניבוי להערכת השפעות של תרכובות על הסבירות לשחרור פרה-סינפטי ועל תפקוד קולטנים פוסט-סינפטיים במערכת טבעית הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני שחרור רב-שלפוביות (multivesicular release) בסינפסה מוגדרת כדי להבהיר תרומות פרה-סינפטיות להעברה עצבית.
- ערך תפעולי: מספק קריאות כמותיות של אמפליטודה ותדירות של זרם פוסט-סינפטי עירורי להערכת תפקוד פרה-סינפטי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות סטנדרטיות וכמותיות של זרם פוסט-סינפטי המתאימות לפיתוח בדיקות המכוונות למחזורי של שלפוחיות סינפטיות.
- ערך תפעולי: תומך בזיהוי הדיר בערך של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים וספונטניים בפריפרציות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין זרימה פנימה של סידן פרה-סינפטית לבין הפעלה של זרם פוסט-סינפטי, מה שמאפשר הפחתת סיכונים בהערכת ההשפעות של מודולטורים של תעלות סידן על תמסורת סינפטית.
- ערך תפעולי: מאפשר ניטור לאורכי של יציבות סינפטית ודיפרסיה במהלך גירוי חוזר, ובכך תומך בתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה ישירה של תמסורת סינפטית בסינפסת סרט (ribbon synapse) מוגדרת, ובכך מספקת מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ומחקרי מנגנון פעולה לפני אופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מנגנוני שחרור פרה-סינפטיים ותגובות קולטנים פוסט-סינפטיים באמצעות הקלטות patch-clamp של תא שלם.
- סריקה: מספק תוצאות מדידות וניתנות לשחזור של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים להערכת השפעת תרכובות על שחרור של ואסיקולות סינפטיות.
- אנליטיקה: מספק התפלגויות של אמפליטודה ותדירות של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים כמדדים כמותיים להשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין דפולריזציה של תאי שערה פנימיים לבין הפעלת סיבים אפרנטיים, תוך מידול של נתיב התמרה תחושתי טבעי הרלוונטי למטרות לטיפול באובדן שמיעה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית סטנדרטית לבדיקה איטרטיבית של מודולטורים סינפטיים לאורך מספר סבבים ניסיוניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית של מודלים של העברה סינפטית באמצעות תצפית ישירה על אירועי שחרור רב-שלפיתוני (multivesicular release).
- ערך תפעולי: מספק הקלטות ברזולוציה זמנית גבוהה עם שונות מינימלית בהכנה, הודות לשיטות סטנדרטיות של מיקרו-אלקטרודות וייצוב רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי הפחתת אי-ודאות בתיקוף מטרות פרה-סינפטיות באמצעות קריאות תפקודיות ישירות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות המכוונות לחלבונים של שלפיתונים סינפטיים או לתעלות סידן, בהתבסס על תגובות פוסט-סינפטיות מאומתות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של השבלול, הכנת מיקרו-אלקטרודות ואלקטרופיזיולוגיה של whole-cell patch-clamp.
- תלוי במיקרו-אלקטרודות באיכות גבוהה עם קטרי קצה בסדר גודל של תת-מיקרון והכנות רקמה מיוצבות באמצעות כיסויי זריקה (cover slips) משוכללים.
- מחייב תמיסות חוץ-תאיות ותוך-תאיות סטנדרטיות כדי להבטיח הקלטות עקביות של זרמים פוסט-סינפטיים.
- הסתגלות למ species או למודלים של גילאים שונים עשויה להשפיע על הנגישות לסיבים אפרנטיים ועל תכונות סינפטיות.
- מוגבל בשל האתגר הטכני של שמירה על יציבות ארוכת טווח של תצורת whole-cell בסיבים אפרנטיים במהלך הקלטות ממושכות.
