Name: הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-10T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: למדו לתעד פעילות פוסט-סינפטית בסינפסת סרט של תאי שיער פנימית באמצעות טכניקת whole-cell patch-clamp בדגם מכרסם. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני עיבוד שמיעה ברמת סינפסה בודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מחקר לחירשות קרן מחקר מענק EY ו NIDCD DC006476 אל EG ועל ידי NIDCD DC005211 למרכז השמיעה ושיווי המשקל, מאוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. אמנות זכויות יוצרים טים פלפס, מאוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס. LG כתב את כתב היד הראשוני; EY ו-LG צילם את לנתיחה ואת ההקלטה. כל המחברים בתנאי דמויות מופת ותרמו בכתב היד.

<ol><li>Glowatzki, E., Fuchs, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmitter+release+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transmitter release at the hair cell ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 5 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Goutman, J. D., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+calcium+dependence+of+transmitter+release+at+a+single+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Time course and calcium dependence of transmitter release at a single ribbon synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 16341-16346 (2007).</li>
<li>Yi, E., Roux, I., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+HCN+channels+shape+excitatory+postsynaptic+potentials+at+the+inner+hair+cell+afferent+synapse+in+the+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic HCN channels shape excitatory postsynaptic potentials at the inner hair cell afferent synapse in the mammalian cochlea.</a> J Neurophysiol. 103 (5), 2532-2543 (2010).</li>
<li>Grant, L., Yi, E., Glowatzki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+release+shape+the+postsynaptic+response+at+the+inner+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two modes of release shape the postsynaptic response at the inner hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 30 (12), 4210-4220 (2010).</li>
<li>LoGiudice, L., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+ribbons+at+sensory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The role of ribbons at sensory synapses.</a> Neuroscientist. 15 (4), 380-391 (2009).</li>
<li>Singer, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nat Neurosci. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Keen, E. C., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+characteristics+of+the+hair+cell%27s+afferent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer characteristics of the hair cell's afferent synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5537-5542 (2006).</li>
<li>Li, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unitary+event+underlying+multiquantal+EPSCs+at+a+hair+cell%27s+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell's ribbon synapse.</a> J Neurosci. 29 (23), 7558-7568 (2009).</li>
<li>Singer, J. H., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+depletion+and+synaptic+depression+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle depletion and synaptic depression at a mammalian ribbon synapse.</a> J Neurophysiol. 95 (5), 3191-3198 (2006).</li>
<li>Suryanarayanan, A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+mediated+by+internal+calcium+stores+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission mediated by internal calcium stores in rod photoreceptors.</a> J Neurosci. 26 (6), 1759-1766 (2006).</li>
<li>Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanism+of+exocytosis+at+the+hair+cell+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanism of exocytosis at the hair cell ribbon synapse.</a> J Neurosci. 27 (47), 12933-12944 (2007).</li>
<li>Tritsch, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+spontaneous+activity+in+the+developing+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origin of spontaneous activity in the developing auditory system.</a> Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).</li>
<li>Kros, C. J., Ruppersberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+potassium+current+in+inner+hair+cells+during+development+of+hearing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression of a potassium current in inner hair cells during development of hearing in mice.</a> Nature. 394 (6690), 281-284 (1998).</li>
<li>Muller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+of+frequency+representation+in+the+rat+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental changes of frequency representation in the rat cochlea.</a> Hear Res. 56 (1-2), 1-7 (1991).</li>
<li>Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

צעד קריטי בהליך זה הוא לנתיחה. אם הרקמה נמתחת או ניזוקו במהלך דיסקציה, סיבים מביא לא ישרדו. רקמות של חולדות צעירות הוא אלסטי יותר סלחני. אנו מוצאים כי ימים לאחר הלידה 10-11 הם הקלה ביותר לנתח וניסויים יש שיעור הצלחה גבוה יותר. תואר משמעותי של התבגרות שבלול מתרחשת לאחר הלידה, עם חולדות מתחילים לשמוע סביב יום הלידה 12 14. לכן, בגיל שבו דיסקציה היא הקלה ביותר, סינפסות לא יכול להיות בוגר מלא 4. דיסקציה המתואר כאן לחולדות הוא בעיקרו זהה עבור עכברים, ההבדל העיקרי הוא בגודל קטן יותר של שבלול העכבר. טכניקה זו מאפשרת את התכונות של סינפסות סרט להיבדק אצל עכברים שונה transgenically 15. שינויים בהמשך טכניקה זו כוללים: הוספת צבע פלואורסצנטי לפתרון תאיים לסיבי תווית 3; הקלטות יחד עם תא שיער presynaptic הפנימית באוטון מביא postsynaptic, המאפשר להעביר פונקציה בין תאים הסינפטי לפני ואחרי שייקבע 2 ומשוחרר- חותם הקלטות תאיים על boutons מביא כדי למנוע אובדן של שלמות התא. תצורת הקלטה תאיים קל יותר להגיע מאשר בתצורת כולו התא ניסויים בדרך כלל לאורך זמן רב יותר.

לעיל הוא ציוד אלקטרו setups שלנו המשמש הקלטה מ מסופי מביא.

הקלטות postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

סינפסה בין תא מביא את השיער הפנימי (IHC) לבין סיבי עצב השמיעה מספק האתר נגיש electrophysiologically הקלטה הפעילות postsynaptic של סרט בודד סינפסה 1-4. סינפסות רצועת הכלים של תאים חושית שחרור הנוירוטרנסמיטר ברציפות, קצב אשר מווסתת בתגובה לשינויים מדורגים בפוטנציאל הממברנה IHC 5. סינפסות רצועת הוכחו פועלים על ידי שחרור multivesicular, שם שלפוחית ​​מרובות ניתן לשחרר זמנית לעורר זרמים postsynaptic מעוררים (EPSCs) משתנה אמפליטודות 1, 4, 6-11. גם התפקיד של הסרט presynaptic, ולא את המנגנון הבסיסי לשחרר multivesicular מובנת כיום היטב. IHC היא מעוצבבים על ידי סיבי עצב השמיעה 10-20, וכל אנשי הקשר הסיב IHC עם אחד unmyelinated סיום להקים סינפסה סרט בודד. גודלו הקטן של IHCs boutons מביא קשר (כ 1 מיקרומטר קוטר) מאפשר הקלטות עם רזולוציה טמפורלית חריגים להתבצע. יתר על כן, הטכניקה ניתן להתאים שיא משני תאים טרום postsynaptic בו זמנית, המאפשר להעביר פונקציה ב הסינפסה להיחקר ישירות 2. שיטה זו ולכן מספק שבאמצעותו היבטים בסיסיים של עצבית ניתן ללמוד, לשחרר multivesicular לתפקד החמקמק של הסרט בתאי חישה.

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

הסינפסה האפרנטית (מסניפה) בין תא השערה הפנימי (IHC) לבין סיב עצב השמיעה מספקת אתר נגיש מבחינה אלקטרופיזיולוגית להקלטה של ה...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט פעילות פוסט-סינפטית בסינפסות אפרנטיות של תאי שערה פנימיים. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת האפיתל החושי של שבלול שהוצא לאחרונה מחולדה שעברה דקפיטציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא מיקום החלק האפיקלי שהוצא על גבי כיסוי זכוכית (cover slip) שעבר התאמה, והעברתו לתא ההקלטה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא לאתר ולהגיע לסיב תחושתי (afferent baton) עם אלקטרודת רישום. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ליצור אטימה הדוקה על ממברנת הסיב התחושתי ואז לפרוץ אותה, כדי לבסס את תצורת התא השלם (whole cell configuration) של טכניקת ה-patch clamp. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות התרחשויות או פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מסינפסת סרט (ribbon synapse) בודדת באמצעות אלקטרופיזיולוגיית patch clamp בתצורת תא שלם.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול (cochlea) קשות ללמידה, והסיבים האפרנטיים הקטנים קשים לזיהוי ולגישה. לפני תחילת הדיסקציה, הכינו כיסוי זכוכית (cover slip) מותאם שיחזיק את הדגימה במקומה במהלך ההקלטות. בעזרת כיסוי זכוכית עגול בקוטר של 8 עד 12 מילימטרים, מרחו טיפה של Sylgard במצב חצי-מ cured לכיוון קצה הכיסוי.הניחו את הקצה העבה של סיכת חרקים דקה על לוכית הכיסוי. החזיקו את סיכת החרקים בחוזקה כנגד הזכוכית. בעזרת פינצטה, חממו את מגן הסף כנגד סליל מחומם כדי לקבע אותו.הכינו 10 עד 20 מיקרו-אלקטרודות כפי שמתואר בטקסט המלווה. לאחר ליטוש באש באמצעות מיקרו-פורג' (micro forge), קוטר הקצה החיצוני של המיקרו-אלקטרודה צריך להיות כמיקרון אחד. העובי הסופי של דופן הפיפטה הוא כשליש מיקרומטר, לאחר הרדמה ועריפת ראש של חולדה בת שלושה שבועות.התחילו את הנתיחה בהסרת העור, לאחר מכן נתחו את הראש והסירה את המוח. כדי לחשוף את עצם הרקה, הסירו את שתי עצמות הרקה. הניחו כל עצם רקה בצלחת נתיחה נקייה המכילה תמיסה חוץ-תאית סטנדרטית. השלב הבא הוא להסיר את העצם העוטפת את עצם הרקה, כדי לחשוף את השבלול.החזיקו את עצם הרקה בבטחה בבסיסה באמצעות פינצטה. זהו את החלון העגול, החלון הביצוי ואת השבלול. כוון את השבלול כך שהחלון הביצוי והצד הספירלי של השבלול פונים כלפי מעלה.הסיר עצם עודפת מסביב לשבלול (cochlea). השתמש בזוג שני של פינצטות עדינות כדי להסיר רסיסי עצם ישירות מהשבלול, והתחל באזור השקוף יותר משאר העצם. באזור זה העצם דקה יותר וקל יותר להסירה.המשיכו להסיר את העצם מסביב לסליל האפקלי (apical coil). השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך דרך המודיוס (modiolus) מתחת לסיבוב האפקלי. לאחר מכן, נתקו את הסיבוב האפקלי מהסיבובים התחתונים של השבלול (cochlea).יש להקפיד להגן על הסליל האפקלי (apical coil). אין למשוך או למתוח אותו. לבסוף, הוצאו את הסיבוב האפקלי מהשבלול (cochlea) תוך הקפדה על מניעת קריעה מרובה של הרקמה.השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את שארית העצם. השלב הבא הוא הסרת ה-STR of oculis והממברנה הטייאלית (tial membrane). הסירו בזהירות את ה-STR of oculis, פס הרקמה המבריק הממוקם מחוץ לאזור תאי השערה.הקפידו להימנע מהסרה של תאי השערה החושיים, שעלולים להיפרד בקלות יחד עם ה-STR של ה-oculis. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את קרומי ה-tial. הקרום המבריק והחצי-שקוף שנמצא מעל תאי השערה החושיים; כעת גזרו רקמות ועצם עודפות והשטיחו את הדגימה באמצעות הפינצטה.דבר זה נחוץ כדי שניתן יהיה להניח את הרקמה באופן אחיד תחת סיכה. שלב הדיסקציה הסתיים כעת. הנח את הדגימה תחת הסיכה על לוכית הכיסוי שהוכנה, תוך הקפדה למקם את הסיכה הרחק מתאי השערה לאחר סיום הדיסקציה.השתמשו בפינצטה כדי להעביר את הדגימה לתא ההקלטה, תוך שמירה על טיפה של נוזל חוץ-תאי על לביבת הזכוכית (cover slip) המחזיקה את רקמת השבלול, והתחילו מיד בפרפוזיה עם תמיסה חוץ-תאית. כדי להבטיח הישרדות טובה יותר של הדגימה, השתמשו בעדשה אובייקטיבית 10x של המיקרוסקופ או בעדשת DIC עם טבילת מים 40x. כדי לאתר את הדגימה, כוונו אותה כך שאלקטרודות ההקלטה יוכלו לגשת לתאי השערה הפנימיים בזווית ישרה לדפנות הצדיות שלהם.אם הנראות של האזור הבזאלי של תאי השערה הפנימיים מוגבלת מכיוון שהדגימה מקופלת, השתמש באלקטרודת רישום כדי לדחוף את הקצה החיצוני של הדגימה מטה אל מול לבישת הזכוכית. יש להקפיד להימנע מלחיצה ישירה על תאי השערה הפנימיים עצמם. בהכנה זו, האלקטרודה העליונה מחזיקה את הקצה החיצוני של הדגימה למטה, והאלקטרודה התחתונה מסמנת את המיקום של ה-afferent batons.לצורך ייחוס, מצלמת ה-NC 70 Nuv Con מציגה את התמונה המוגדלת של ה-Forex על המסך כדי להעריך האם הרקמה באזור תאי השערה הפנימיים בריאה. אתר את צמורי השערה כנקודת ייחוס ובצע פוקוס כלפי מטה כדי למצוא את הגרעינים. בצע פוקוס נוסף כלפי מטה לכיוון בסיס תאי השערה הפנימיים עם הסיומות האפרונטיות שלהם, ולאחר מכן פוקוס חזרה למעלה עד להגעה לגובה הגרעינים על המסך.כעת אתרו את הבטונים האפרנטיים (afferent batons) סביב בסיסן של תאי השערה הפנימיים. הבטונים הם כדוריים או אליפסואידיים, בקוטר של כ-one micron, והם בהירים בצבעם בעלי מראה מבריק. ניתן למצוא אותם באמצעות מיקוד מעלה ומטה.השלב הבא הוא לפנות נתיב לסיבים האפרנטיים (afferent fibers) באמצעות אלקטרודת רישום בעלת קצה של מיקרון אחד הממולא בתמיסה תוך-תאית. הפעל לחץ חיובי והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי להניע את האלקטרודה לעבר הדגימה. השתמש באלקטרודה זו כדי לבצע חתך בדגימה בגובה בסיס תאי השערה הפנימיים.דחפו את האלקטרודה בין השכבה הדקה של התאים התומכים לבין תאי השערה הפנימיים באמצעות לחץ חיובי כדי ליצור נתיב גישה לאזור בבסיס תאי השערה הפנימיים. הוציאו בזהירות את האלקטרודה והחליפו אותה באלקטרודה חדשה עם קצה בקוטר מיקרון אחד המלא בתמיסה תוך-תאית. תוך שימוש בלחץ חיובי לשמירה על קצה אלקטרודה נקי, הניעו את אלקטרודת ההקלטה דרך חור הגישה, מסביב לתאים תומכים סמוכים, לעבר ה-afferent baton.יש לוודא שקצה האלקטרודה נמצא ישירות מול ה-afferent bouton; ה-boutons מציעים התנגדות רבה יותר לתנועת הפ pipette מאשר התאים התומכים וממברנת תאי השערה הפנימיים. ניתן להרגיש הבדל זה בעת הזזת ה-pipette; יש להניע את ה-pipette מעלה ומטה וללחוץ כדי לוודא שה-bouton זז. דבר זה מעיד על כך שקצה ה-pipette וה-bouton נמצאים באותו מישור מיקוד, כאשר האלקטרודה לחוצה כנגד ה-afferent bouton. במקביל, יש לשחרר את הלחץ החיובי ולהפעיל יניקה כדי ליצור giga ohm seal.בצעו משיכות ואקום קצרות ועדינות כדי לקרוע את הממברנה בתוך האלקטרודה ולהשיג רישום של תא שלם (whole cell recording). אם התא שנבחר לתיקוע (patched) הוא סיב אפרנטי מסוג baton, נצפו תופעות קיבוליות חולפות (capacitive transients) קטנות במצב רישום של תא שלם. איור זה מציג תגובה חולפת טיפוסית שנרשמה מסיב אפרנטי.התחל בהקלטת הפעילות הסינפטית. אם הסיב האפרנטי אינו מפגין פעילות ספונטנית, גרם לדפולריזציה של תא השערה באמצעות יישום של תמיסה חוץ-תאית בעלת ריכוז אשלגן גבוה יותר. איור זה מציג קשרי זרם-מתח טיפוסיים עבור סיבי AFF משמאל ותאי שערה פנימיים מימין.קשרי זרם-מתח נרשמו בפוטנציאל החזקה של 84- millivolts עם מדרגות מתח מ-124- millivolts עד 36+ millivolts במרווחים של 10 millivolt. המתחים מוצגים מימין לחלק מהעקבות, תוך התמקדות בקשרי זרם-מתח מסיב אפרנטי. שימו לב כי אירועים פוסט-סינפטיים מעוררים או EPCs נוכחים במהלך מרבית מדרגות המתח.ה-EPCs הפכו לחיוביים בערך ב-6 millivolts חיוביים. הקלטה זו בוצעה בנוכחות של tetrodotoxin כדי לחסום זרמי נתרן תלוי-מתח; ללא החוסם, היו מופיעים בהקלטה גם זרמי נתרן פנימה בעלי הפעלה מהירה, מה שהיה מזהה את ההקלטה כהקלטה של סיב אפרנטי. שימו לב לזרם הפנימה בעל ההפעלה האיטית במתחים היפר-פולריים.זרם זה אינו קיים בתאי שיער פנימיים או בתאי תמיכה, והוא מהווה אינדיקציה טובה לכך שההקלטה היא מסיב אפרנטי. הקלטות אלו מראות את יחסי המתח-זרם של תא שיער פנימי. החץ מצביע על זרמי אשלגן יוצאיים עם הפעלה מהירה בפוטנציאלים חיוביים.לאחר מכן מופיעים זרמי אשלגן של מיישרים מושהים (delayed rectifier potassium currents) עקב קוטר פיפטה צר והתנגדות גישה גבוהה. זרמי תאי השערה הפנימיים המוצגים כאן קטנים מהמצופה כדי להשיג הקלטות מדויקות של זרמי תאי שערה פנימיים. יש להשתמש בפיפטות בעלות התנגדויות גישה נמוכות יותר.עם זאת, ההקלטות המוצגות כאן מדגימות כי ניתן להבחין בבירור בין יחסי זרם-מתח של תאי שיער פנימיים לבין אלה של סיבים אפרנטיים. איור זה מציג זרמים סינפטיים שהוקלטו מסיב אפרנטי. שימו לב לגודל ולצורה המשתנים של ה-EPCs.ההקלטות בוצעו בטמפרטורת החדר עם יישום של tetra toin כדי לחסום את זרמי הנתרן תלויי-מתח. איור זה מציג הקלטות סימולטניות מתא שיער פנימי ומבטון אפרנטי (afferent baton) במגע עמו. מדרגת מתח שימשה לדפולריזציה של תא השיער הפנימי, ובתגובה נרשמו זרמי סידן פנימה מתא השיער הפנימי; זרימת הסידן פנימה גורמת לשחרור מוליכים עצביים ולהפעלת EPCs בבטון האפרנטי.שימו לב לדיכוי הסינפטי המופיע במהלך דפולריזציה של 50 מילישניות של תאי שיער פנימיים בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור לנהוג בזהירות בעת הדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול, ולהישאר סבלניים ואופטימיים בעת הניסיון להקליט מטרמינלים אפרנטיים.

postsynaptic-recordings-at-afferent-dendrites-contacting-cochlear

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.

Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית

סרטון זה מדגים את ההקלטה המשולבת של פלט afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי השיער של פינת עכבר. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בגירוי מכני של קצות העצבים של זקיקי השערה לפני ואחרי חשיפה לצבע פלואורסצנטי של קרום השיער, רישום אלקטרופיזיולוגי של פוטנציאלי הפעולה שנוצרו, והדמיה של תיוג מסוף העצבים בזקיקי השיער.

הקלטה משולבת של תפוקת Afferent מגורה מכנית ותיוג מסוף עצבי בזקיקי שיער עכבר

סרטון וידאו זה מדגים שיטה להערכת סינפסות רצועת הכלים באזורים ספציפיים של שבלול העכבר. הוא משתמש בטכניקות דימות חיסוני וקונפוקלי כדי לזהות סינפסות תפקודיות על פני אזורי תדר שונים בכל סיבוב שבלול.

הערכה של סינפסות ברצועת הכלים באזורי תדר ספציפיים של שבלול העכבר

מוצגת טכניקה פשוטה וחדשנית לרישום פריקה אפרנטית עקב גירוי מכני של מסופי lanceolate של קצות ה-palisade המעצבבים את עור אוזן העכבר, זקיקי שיער.

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

כתב יד זה מתאר פרוטוקול ניסיוני להערכת מאפיינים מורפולוגיים ומעמד פונקציונלי של הסינפסות של רצועת הכלים בעכברים נורמליים. המודל הנוכחי מתאים גם לרעש המושרה והקשורות לגיל synaptopathy מודלים מוגבלים. גם התוצאות של לימודי העכבר הקודמים נדונו.

מורפולוגית ופונקציונלית הערכה של הסרט סינפסות בתדר ספציפי אזורים של העכבר שבלול

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

מוצג פרוטוקול לעיבוד שבלול גרביל צעיר ומזדקן על ידי סימון חיסוני של המבנים הסינפטיים ותאי השערה האפרנטיים, מרווה אוטופלואורסצנטיות ברקמה מזדקנת, ניתוח והערכת אורך השבלול, וכימות הסינפסות בערימות תמונה המתקבלות בהדמיה קונפוקלית.

סינפסות סרט אימונו-לבלים וספירתם בשבלול גרביל הצעיר והזקן

מוצגות כאן שיטות המספקות הוראות מפורטות לניתוח, ניתוק, תרבית ורישום מהדק טלאי מגנגליון שיווי המשקל ונוירוני גנגליון ספירלי באוזן הפנימית.

בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

למדו לתעד פעילות פוסט-סינפטית בסינפסת סרט של תאי שיער פנימית באמצעות טכניקת whole-cell patch-clamp בדגם מכרסם. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני עיבוד שמיעה ברמת סינפסה בודדת.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

גלה סרטונים נוספים