כימות דיכוי ביופילם המושר על ידי אנזימים בחיידקים פתוגניים

קחו מיקרופלטה המכילה בארות בקרה וטיפול, שכל אחת מהן מחוסנת בחיידק פתוגני יוצר ביופילם.

בארות הטיפול מכילות אנזים שמפריע להיווצרות ביופילם.

דגרו בתנאים מיקרו-אנאירוביים ליצירת סביבה דלת חמצן. זה מקדם הפרשת מולקולות איתות חיידקיות המתווכות הידבקות פני השטח. בבארות הטיפול, האנזים מפרק את המולקולות הללו, ובכך מפחית את ההיצמדות של חיידקים.

שטוף את הבארות כדי להסיר תאים לא דביקים למים.

הכניסו מדיום טרי ודגרו. החיידקים הדבוקים מתרבים ומפרישים חומרים פולימריים חוץ-תאיים, היוצרים את מטריצת הביופילם.

הסר את המדיום ושטוף את הבארות.

הוסיפו צבע קטיוני ודגרו כדי לאפשר קשירה לרכיבי ביופילם טעונים שלילית.

שטוף כדי להסיר צבע שלא קשור.

דגרו עם ממס תחת ערבוב כדי לשחרר את הצבע הקשור לתמיסה.

מדוד את צפיפות האופט או OD כדי לכמת את הביומסה של הביופילם.

רמת מנת חמצון נמוך יותר בבארות הטיפול משקפת ירידה ביצירת ביופילם, הנובעת מפגיעה בהיצמדות התא הראשונית.

כדי להתחיל, גדל תרבית של 5 מיליליטר של A.baumannii S1 ב-LB בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במדגם רועד למשך 16 שעות.

כוון את התרבות ל-OD₆₀₀ של 0.8. לאחר מכן השתמש ב-LB טרי המכיל 4 מיליגרם לכל מיליליטר של אנזים GKL מטוהר כדי לדלל את התרבית 1 עד 100. ולהוסיף 100 מיקרוליטר לבארות של לוח עם 96 בארות.

השתמשו במכסים כדי לכסות את הצלחות, והניחו אותן במיכל פלסטיק בנפח 10 ליטר. אטום את המיכל ודוגר בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות לפני הסרת המדיום בעדינות. הוסיפו עוד 100 מיקרוליטר של מדיום LB טרי לבארות, ודוגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 21 שעות.

לאחר הסרה עדינה של המדיום, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מים סטריליים כדי לשטוף בעדינות את תאי החיידקים הפלנקטוניים. מקם את קצה הפיפטה בתחתית הבאר והסירו בזהירות את המדיום הנוזלי כדי להבטיח מינימום הפרעות על הביופילם הזר בין ממשק האוויר לנוזל. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת סיגלית קריסטלית 1% לכל באר, ודגרו אותה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת הסגול הקריסטלי על ידי שימוש ב-200 מיקרוליטר מים סטריליים לשטיפת הבארות שלוש פעמים. הוסיפו 100 מיקרוליטר של חומצה אצטית 33% לכל באר ודגרו בעדינות במשך 15 דקות כדי להמיס את הצבע. כמת את כמות הביופילם על ידי מדידת הספיגה של קריסטל סגול ב-600 ננומטר. כמות הסגול הקריסטלי פרופורציונלית לכמות הביופילם שנוצרת.