בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיטוכונדריה ולבצע נשימה מיטוכונדריאלית. זה מושג על ידי בידוד שרירי השלד מחולדות ריסוס. לאחר מכן, השריר הומוגני והמיטוכונדריה מבודדים על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן נקבע ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד. לבסוף, נשימה מיטוכונדריאלית נמדדת על ידי פוליגרפיה. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות צריכת חמצן דרך מצבי הנשימה המיטוכונדריאלים השונים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שרירי השלד, כגון ההשפעה של התערבויות שונות בתפקוד המיטוכונדריה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חילוף החומרים של שרירי השלד, ניתן ליישם אותה גם על איברים אחרים כגון כבד, מוח, כליות או כמעט כל רקמה לפני תחילת ההליך. כדי לבודד את שרירי השלד, הכינו את הפתרונות הבאים, P-B-S-P-B-S בתוספת 10 מילי-מולרי EDTA, שמונה פעמים מאגר בידוד מיטוכונדריה מאגר אחד או IB אחד, מאגר בידוד שניים או IB שניים ומאגר ניסיוני או eb.

ראה את הפרוטוקול הכתוב המצורף להוראות. לאחר מכן, הפעל את הצנטריפוגה והגדר אותה לארבע מעלות צלזיוס. הפעל אמבט מים והגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס.

בדלי נחמד, הניחו שלוש כוסות של 10 מיליליטר, מרפק פוטר, מטחנות רקמות אבני חן, מספריים כירורגיות קטנות ו-10 צינורות מיקרו צנטריפוגות על קרח. הכל חייב להישאר קר כקרח לאורך כל הניסוי. הנח את IB 1 ו-IB 2 על ICE ו-EB לאמבט מים חמים.

לאחר מכן הוסף את הפתרונות הבאים לשלוש הכוסות על קרח, 10 מיליליטר של PBS, שתיים של 10 מיליליטר של P-B-S-E-D-T-A. שלוש. שלושה מיליליטר של ib. יש להמית חולדה על פי הנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומיץ.

לאחר מכן, בודד במהירות 250 עד 500 מיליגרם של שרירי השלד בעזרת מלקחיים ומספריים של מאיו קליניק. שטפו אותו בבקה אחת, ואז העבירו אותו לבקה-שתיים, כדי להפוך את השריר להומוגניזציה. ראשית, העבירו אותו לכוס שלוש, ולבסוף טחנו אותו במספריים.

העבירו את התמיסה להומוגניזטור אבני חן של אלבה הומוגני את השריר באמצעות עלי ממונע 10 פעמים, תוך שמירה על הצינור בקרח כל הזמן. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למיקרו צנטריפוגה של שני מיליליטר, צינורות וצנטריפוגה מקוררים מראש ב-700 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט S לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש שהוגש מראש והשליכו את צנטריפוגת הגלולה.

ה-S supernatant ב-10, 500 Gs למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, העבירו את ה-SNAT לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש מלא מראש וסמנו אותו עם SN one וסוג שריר Reese. השעו את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של IB שתיים, ואז צנטריפוגה ב-10, 500 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופינטה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש מלא מראש וסמנו אותו עם SN 2 וסוג השריר.

השעו את הגלולה המיטוכונדריאלית הסופית ב-100 מיקרוליטר של IB שתיים. סובב אותו במיני פוגה למשך מספר שניות. אם יש גלולה, העבירו את הסופינטה לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש מלא מראש והשליכו את הגלולה כיול אלקטרודת החמצן הוא שלב מפתח בפרוטוקול זה ויש לבצע אותו מדי יום.

ניתן להשלים את כיול האלקטרודה במהלך הבידוד המיטוכונדריאלי. כדי להתחיל, הוסף 100 מיליליטר מים מזוקקים לכוכב בקבוק של 250 מיליליטר במרץ למשך 20 דקות. כדי לאזן את המים בגז אטמוספרי, כסו את אלקטרודת GRAT בכמה טיפות של 50% אשלגן כלורי.

לאחר מכן הניחו חתיכה קטנה של נייר גלגול ריזלה כחול על גבי האלקטרודה. ואז חתיכת קרום PTFE. על גבי נייר הגלגול.

החל את הטבעת הפנימית באמצעות מוליך הטבעת, ולאחר מכן הנח את הטבעת החיצונית בחריץ האלקטרודה. חבר את האלקטרודות והרכיב את בסיס טבעת הפלסטיק הגדול יותר, תא המיטוכונדריה וצינורות המים. הפעל את קופסאות GRAT והפעל את תוכנת GRAS.

הוסף את המים המאוזנים לתא המיטוכונדריה. לאחר מכן הוסיפו מוט ערבוב כדי להפעיל את מוט הערבוב. לחץ על חומרה.

ואז מערבבים מהירות. כוונן את המהירות ל-60 ולחץ על. לאחר מכן, התחל ניסוי חדש.

לחץ על כיול ולאחר מכן על כיול שלב נוזלי. עבור תיבה ראשונה, שנה את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ולחץ על אישור פעמיים. כאשר העקיפה משתנה ל, בסדר, לחץ עליו ופתח את מיכל גז החנקן.

הנח את הקצה המחובר למיכל החנקן לתוך התא וצור אפס חמצן. לחץ על אישור כאשר הוא עובר מעקיפה. שאפו את המים והוסיפו 500 מיקרוליטר EB לתאי המיטוכונדריה.

אטום את החדר בעזרת בוכנה. אם אתה משתמש במספר תיבות, חזור על שלב הכיול עבור כל תיבה. התחילו ניסוי חדש ותנו לו לפעול במשך כדקה.

כדי לייצב את האות, הוסף את הנפח הדרוש של תרחיף המיטוכונדריה כדי להגיע ל -150 מיקרוגרם בכל תא. סמן את האירוע ותן לו לרוץ. למשך דקה אחת, הוסיפו 10 מיקרוליטר של גלוטמט חם של 250 מילי-מולרי, 125 מילי-מולארי מלאט לריכוז סופי של 5 מילי-מולרי גלוטמט, 2.5 מילי-מולרי מלאט ותנו לו לפעול במשך דקה אחת.

זה מוגדר כמצב שני. לאחר מכן, הוסף 7.5 מיקרוליטר של 10 מילימולר DP לריכוז סופי של 150 מיקרומולר. לאחר מכן סמן ותן לו לפעול במשך 30 שניות.

זה מוגדר כמצב שלוש. הוסף עוד 7.5 מיקרוליטר של 10 מילימולר לסימן DP, ותן לו לפעול במשך 1.5 דקות. הוסף 0.5 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי אוליגו מיצין קר לריכוז סופי של סימן מיקרו-מולרי אחד, ותן לו לפעול במשך שלוש דקות.

זה מוגדר כמצב ארבע. הוסף מיקרוליטר אחד של FCCP קר, 0.1 מילי-מולרי לריכוז סופי של 0.2 מיקרו-מולארי, ותן ל-RUM למשך שלוש דקות. זה מוגדר כמצב חמש.

בסיום, סיים את הניסוי ושמור אותו. רכוש את קצבי הנשימה באמצעות תוכנת הרפסודה. הזן את גורם הנורמליזציה.

אם מוסיפים 150 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי, גורם הנורמליזציה יהיה 0.15. חשב את קצב הנשימה המנורמל עבור מצבי הנשימה השונים. חשב את יחס בקרת הנשימה או RCR על ידי חלוקת מצב שלוש במצב ארבע.

איור זה מציג מעקב מייצג אחר צריכת החמצן על ידי שרירי השלד. המיטוכונדריה. לאחר ייצוב אות האלקטרודה, דגימת המיטוכונדריה מתווספת לתא ה-RAT. מצב שני, הנשימה מתחילה בתוספת גלוטמט ומלאט.

תוספת של DP מגדילה את צריכת החמצן. הגדרת מצב שלוש. נשימה סינטאז TP נחסם על ידי תוספת של ליגה מיצין כדי להשיג נשימה במצב ארבע.

לבסוף, FCCP מתווסף לניתוק נשימה מיטוכונדריאלית. תרשים זה מציג את שיעורי צריכת החמצן המייצגים עבור מדינות 2, 3, 4 ו-5. יחס בקרת הנשימה או RCR מחושב עבור כל ניסוי.

RCR גדול מארבעה נחשב לעדות להכנת מיטוכונדריה בת קיימא בזמן ניסיון הליך זה. חשוב לשמור דגימות מיטוכונדריה בקרח כל הזמן. בצע הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתמים מערביים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תכולת חלבונים מיטוכונדריאליים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד את המיטוכונדריה משרירי השלד כמו גם את הנשימה המיטוכונדריאלית.