Name: בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו לבודד מיטוכונדריות משלד ולמדוד נשימה מיטוכונדריאלית בשיטת פוליגרפיה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת פונקציה מיטוכונדריאלית באמצעות ניתוח צריכת חמצן במצבי נשימה שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מן העין לאומי (R01 EY12998) כדי FH אנדרדה.

1. הכנת Buffers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל 5804R צנטריפוגות ולהגדיר עד 4 ° C. הפעל אמבט מים Isotemp להגדיר 3006D ו 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים לפני בידוד שרירים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS: ממיסים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) טבליות במים מזוקקים (5 טבליות / ליטר). מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PBS פלוס 10 mM EDTA: כדי להכין פתרון 100 מ"ל, להוסיף 2 מ"ל של 500 mM EDTA עד 98 מ"ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ המיטוכונדריה 8X: 10.28 גרם של סוכרוז לריכוז סופי של 0.6 מ ', 400 מ"ג של חומצת שומן חופשית שור בסרום אלבומין (BSA) ריכוז סופי של 0.8%, 2.08 גרם של HEPES ריכוז סופי של 160 mM, pH עד 7.4 ו QS ל 50 מ"ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר בידוד 1 (IB1): הוסף 200 μl של 500 mM EDTA בריכוז סופי של 10 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 1.25 מ"ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ"ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר בידוד 2 (IB2): הוסף 60 μl של EGTA 500 מ"מ ריכוז סופי של 3 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 1.25 מ"ל של 8X pH המיטוכונדריה חיץ, כדי 7.4 ו QS עד 10 מ"ל עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר ניסיוני (EB): הוסף 100 μl של 500 mM MgCl 2 בריכוז סופי של 5 מ"מ, 0.392 גרם של D-mannitol ריכוז סופי של 215 מ"מ, 25 מ"מ μl 2.5 KH 2 PO 4 בריכוז סופי של 6.25 מיקרומטר, 2 μl של 100 מ"מ EGTA ריכוז סופי של 20 מיקרומטר, 1.25 מ"ל של חיץ המיטוכונדריה, pH 7.4 ל ו QS ל 10 מ"ל עם מים מזוקקים. </li></ul></li></ol> 2. בידוד שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך דלי קרח, להכניס שלוש כוסות 10 מ"ל, פוטר, Elvehjem ומטחנות רקמות כל צורך במכשירים אחרים / אספקה ​​על הקרח. כל דבר חייב להישאר קר כקרח במשך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום IB1 ו IB2 בדלי קרח EB באמבט מים חמים בסיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלוש כוסות 10 מ"ל, פתרונות הבא יש להוסיף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 1: 10 מ"ל של PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 2: 10 מ"ל PBS / EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Beaker 3: 3 מ"ל של IB1 </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהרגו עכברוש אנושי כפי שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים המקומי ועדת שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד במהירות 250-500 מ"ג של שרירי השלד, לשטוף בכוס 1, ולאחר מכן להעביר Beaker 2. </li></ol> 3. Homogenization / בידוד מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שריר Beaker 3 דק לקצץ את השריר עם מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הפתרון homogenizer פוטר-Elvehjem. Homogenize השריר באמצעות העלי ממונע (מקדחה יעשה את העבודה) 10 פעמים לשמור את הצינורית קרח בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת homogenate מראש צונן צינורות microcentrifuge 2 מ"ל ו - 700 גרם ב צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge. בטל גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN1 תווית (מספר supernatant 1) וסוג השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות גלולה ב 500 μl של IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 10,500 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge ו SN2 תווית (מספר supernatant 2) וסוג השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות הסופי המיטוכונדריה גלולה ב 100 μl של IB2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-ספין ההשעיה המיטוכונדריה הסופי minifuge במשך כמה שניות. אם יש גלולה, העברת supernatant לצינור מראש צונן חדש microcentrifuge וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד 8. </li></ol> 4. אלקטרודה כיול הערה: כיול האלקטרודה השלם במהלך בידוד המיטוכונדריה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 100 מ"ל מים מזוקקים כדי בקבוק 250 מ"ל. מערבבים נמרצות במשך 20 דקות כדי לאזן את המים עם הגז האטמוספרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כמה טיפות של 50% KCl אל האלקטרודה Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת נייר קטנה ה"ריזלה כחול מתגלגל על ​​גבי האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת PTFE קרום על גבי הנייר מתגלגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הטבעת הפנימית באמצעות המוליך הטבעת ולאחר מכן למקם את הטבעת החיצונית של החריץ אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור אלקטרודות ולהרכיב את שאר הציוד: בסיס טבעת פלסטיק גדולה, חדר המיטוכונדריה, וצינורות מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תיבות Oxygraph ולהתחיל תוכנה Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את המים equilibrated לתא המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ומערבבים בר להדליק למהירות של 60. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין ניסוי חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כיול ולאחר מכן כיול שלב נוזלי תיבה 1. שינוי הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס ולחץ על "אישור" פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר "עקיפת" שינויים "אישור" לחץ עליו לפתוח את מיכל הדלק חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קצה מחוברלמיכל חנקן לתוך תא ולהקים חמצן אפס. לחץ על "אישור" כאשר הוא עובר מן "עקיפת". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב מים ולהוסיף 500 μl של חיץ EB לתאי המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם קאמרית עם הבוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה משתמש תיבות מרובים, חזור על שלבים 11-15 עבור כיול של תיבה 2. </li></ol> 5. מיטוכונדריאלי נשימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ניסוי חדש, לתת לו לרוץ במשך דקה 1 על מנת לייצב האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הנפח של ההשעיה המיטוכונדריה (שלב 3.11) עבור 150 מיקרוגרם בתא אחד, אירוע לציון, ולתת לו לרוץ במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של חם 250 mM/125 mM גלוטמט / Malate ריכוז סופי של mM mM/2.5 5. מארק בוא לרוץ במשך דקה 1. זו מוגדרת כמדינה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 7.5 μl של 10 mM ADP ריכוז סופי של 150 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 30 שניות. זו מוגדרת כמדינה 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 7.5 מ"מ 10 ADP, לסמן, ולתת לרוץ 1.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 0.5 μl של oligomycin 10 קר mM ריכוז סופי של 1 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של קור 0.1 מ"מ FCCP ריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר, לסמן, ולתת לרוץ במשך 3 דקות. זו מוגדרת כמדינה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, בסוף הניסוי ולשמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את שיעורי הנשימה באמצעות תוכנת Oxygraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן גורם נורמליזציה: אם הוספת 150 מיקרוגרם של חלבון המיטוכונדריה, הגורם נורמליזציה יהיה 0.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב שיעור הנשימה מנורמל עבור מדינות נשימה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס בקרת הנשימה (RCR) על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4. </li></ol> 6. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מציגה נציג מעקב אחר צריכת החמצן של שריר השלד המיטוכונדריה. לאחר האות אלקטרודה הוא התייצב, המדגם המיטוכונדריה מתווסף חדר Oxygraph. מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט Malate. תוספת של ADP עולה צריכת החמצן, הגדרת 3 הנשימה המדינה. ה-ATP synthase חסומה על ידי תוספת של oligomycin להשיג 4 הנשימה המדינה. לבסוף, FCCP מתווסף לנתק הנשימה במיטוכונדריה (מצב 5). טבלה 1 מראה חמצן נציג שיעורי הצריכה של 2 מדינות, 3, 4 ו - 5. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) מחושב עבור כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ארצות </td><td> מנורמל חליפין </td></tr><tr><td> המדינה 2 </td><td> 34.74 </td></tr><tr><td> מדינת 3 </td><td> 153.40 </td></tr><tr><td> המדינה 4 </td><td> 16.49 </td></tr><tr><td> המדינה 5 </td><td> 143.70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9.30 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הנשימה שיעורי מיטוכונדריאלי. Representativeoxygen שיעורי הצריכה של שרירי השלד המיטוכונדריה. ערכים הם מנורמל לכמות של המיטוכונדריה הוסיף לחדר. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) נקבעת על ידי חלוקת המדינה 3 על ידי המדינה 4. RCR ≥ 4 מהווה הכנה המיטוכונדריה קיימא.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנו מציגים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד. אם התשואה היא בעיה, פרוטוקול ניתן לשנות על ידי דוגרים על שריר בודד 5 מ&quot;ל של טריפסין EDTA/0.01% PBS/10mM במשך 30 דקות בקרח. כדי להבטיח עיכול שרירים להשלים עם טריפסין, השריר צריך להיות טחון לגמרי. לאחר דגירה של 30 דקות, הפתרון PBS/10mM טריפסין EDTA/0.01% חייב להיות מוחלף לחלוטין עם 3 מ&quot;ל של חיץ בידוד 1 (IB1). בנוסף, השימוש טריפסין מסוימים עלולים להפריע מצעים המיטוכונדריה במהלך הפרוטוקול הנשימה. כל מצעים בשימוש תוצ...

<table><tbody><tr><td>תערובת 95% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / 5% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ספק גז מקומי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של Adenosine 5&amp;#8242;-diphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>נייר Blue Rizla</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>ערכה למדידת חלבון בשיטת Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חנקן דחוס</td><td>ספק גז מקומי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מ huyết של בקר נטול חומצות שומן חופשיות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>חומצה גלוטמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן של HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>חולדות זכר Sprague Dawley</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>חומצה מאלית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>דיסקית אלקטרודת חמצן</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Oxygraph Plus V1.01</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מד pH</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>סליין עם בופר פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>הומוגניזטורים מסוג Potter-Elvehjem</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת PTFE (0.0125mm &amp;#215; 25mm)</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה SKIL 3320</td><td>חנות חומרי בניין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

המיטוכונדריה הם אברונים שליטה על החיים והמוות של התא. הם משתתפים תגובות מטבוליות מפתח, לסנתז ביותר של ה-ATP, ולהסדיר מספר איתות מפלי 2,3. חוקרים בעבר ובהווה יש לבודד מרקמות המיטוכונדריה חולדות ועכברים כגון מוח, כבד, לב 4,5. בשנים האחרונות, חוקרים רבים התמקדו לומד לתפקד המיטוכונדריה של שרירי השלד. כאן אנו מתארים שיטה השתמשנו בהצלחה הבידוד של המיטוכונדריה מן שרירי השלד 6. ההליך שלנו דורש שכל מאגרים ו ריאגנטים עשויים טריים צורך כ 250-500 מ&quot;ג של שרירי השלד. למדנו המיטוכונדריה מבודד הגסטרוקנמיוס חולדה ועכבר הסרעפת, ואת שרירי extraocular חולדה. ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי נמדדת עם assay ברדפורד. חשוב דגימות המיטוכונדריה להישמר קרים כקרח במהלך ההכנה כי מחקרים פונקציונלי להתבצע בתוך זמן קצר יחסית (~ 1 שעות). הנשימה מיטוכונדריאלי נמדד polarography עם אלקטרודה מסוג קלארק (מערכת Oxygraph) בשעה 37 ° C 7. כיול אלקטרודת חמצן הוא צעד מפתח פרוטוקול זה והיא חייבת להתבצע מדי יום. המיטוכונדריה מבודד (150 מיקרוגרם) מתווספים 0.5 מ&quot;ל של חיץ ניסיוני (EB). מדינת 2 הנשימה מתחיל עם תוספת של גלוטמט (5mm) ו Malate (2.5 מ&quot;מ). ואז, diphosphate אדנוזין (ADP) (150 מיקרומטר) מתווסף להתחיל המדינה 3. Oligomycin (1 מיקרומטר), חוסם synthase ATPase, משמש אומדן המדינה 4. לבסוף, קרבוניל ציאניד p-[trifluoromethoxy]-פניל-hydrazone (FCCP, 0.2 מיקרומטר) מתווסף measurestate 5, או זוגיים הנשימה 6. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR), היחס של המדינה 3 למצב 4, מחושב לאחר כל ניסוי. RCR ≥ 4 נחשב כהוכחה הכנה המיטוכונדריה קיימא. לסיכום, אנו מציגים שיטה הבידוד של המיטוכונדריה קיימא של שרירי השלד כי ניתן להשתמש ביוכימית (למשל, פעילות האנזים, immunodetection, proteomics) מחקרים תפקודית (נשימה המיטוכונדריה).

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ Scorrano<em&gt; Et al.</em&gt; (2007). ההליך בידוד המיטוכונדריה דורשת כ 2 שעות. הנשימה המיטוכונדריאלי ניתן להשלים תוך שעה בערך 1.

מיטוכונדריה הן אבנים שהן אורגנלות השולטות על חייה ומותה של התא. הן משתתפות בתגובות מטבוליות מרכזיות, מסנתזות את רוב ה-ATP, ו...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיטוכונדריה ולבצע מדידת נשימה מיטוכונדריאלית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד שריר שלד מחולדות המייובשות בהתזה. לאחר מכן, השריר עובר הומוגניזציה והמיטוכונדריה מבודדות באמצעות סנטריפוגציה.לאחר מכן, ריכוז החלבון נקבע באמצעות בדיקת ברדפורד (Bradford assay). לבסוף, נשימה מיטוכונדריאלית נמדדת באמצעות פוליגרפיה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות צריכת חמצן דרך מצבי הנשימה המיטוכונדריאליים השונים.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום השריר השלדי, כגון השפעת התערבויות שונות על התפקוד המיטוכונדריאלי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מטבוליזם בשריר השלדי, ניתן ליישמה גם על איברים אחרים כגון כבד, מוח, כליה, או כמעט כל רקמה אחרת. לפני תחילת הפרוצדורה, להכנת בידוד של שריר שלדי, הכין את התמיסות הבאות: P-B-S, P-B-S בתוספת 10 millimolar EDTA, באפר בידוד מיטוכונדריה פי 8, באפר בידוד 1 או IB1, באפר בידוד 2 או IB2 ובאפר ניסויי או EB.ראו את הפרוטוקול הכתוב המצורף להוראות. לאחר מכן, הפעילו את הצנטריפוגה וכוונו אותה ל-4 °C. הפעילו מקבץ מים וכוונו אותו ל-37 °C.בתוך דלי מתאים, הניחו שלושה כוסות כימיות של 10 milliliter, potter elbow, מטחני רקמה של gem, מספריים כירורגיים קטנים ו-10 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה על קרח. יש לשמור על כל הרכיבים קרים מאוד לאורך כל הניסוי. הניחו את IB one ואת IB two על קרח ואת EB בתוך מקבץ מים חמים.לאחר מכן, הוסיפו את התמיסות הבאות לשלוש כוסות המעבדה שעל הקרח: לכוס אחת 10 milliliters של PBS, לכוס שתיים 10 milliliters של P-B-S-E-D-T-A, ולכוס שלוש 3 milliliters של ib. 1. השמידו חולדה בהתאם לנהלים המאושרים על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים ושגרירותם (IACUC).בשלב הבא, בודדו במהירות 250 עד 500 מיליגרם של שריר שלד באמצעות פינצטה ומספרי Mayo. שטפו את הרקמה בבכור one, ואז העבירו אותה לבכור two, כדי להומוגניзировать את השריר. ראשית, העבירו אותו לבכור three, ולבסוף קצצו אותו בעזרת מספריים.העבירו את התמיסה להומוגניזטור מסוג potter Elva והומוגניזו את השריר באמצעות עקת מנוע 10 פעמים, תוך שמירה על המבחנה בקרח בכל עת. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 ml שקוללו מראש, וסובבו בצנטריפוגה ב-700 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את הסופרנטנט למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה שקוללה מראש והשליכו את המשקע.סנטריפוגה את העלייה (supernatant) ב-10,500 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, העבר את ה-SNAT למבחנת מיקרו-סנטריפוגה חדשה ומלאה מראש, וסמן אותה כ-SN1 וסוג השריר. השהה את המשקע (pellet) ב-500 µL של IB2, ולאחר מכן בצע סנטריפוגה ב-10,500 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. העבר את העלייה למבחנת מיקרו-סנטריפוגה חדשה ומלאה מראש, וסמן אותה כ-SN2 וסוג השריר.שעלה את משקע המיטוכונדריה הסופי ב-100 microliters של IB two. סובב אותו במיני-צנטריפוגה למשך מספר שניות. אם נוצר משקע, העבר את הנוזל העליון למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה הממולאה מראש והשלך את המשקע. כיול אלקטרודת החמצן הוא שלב מרכזי בפרוטוקול זה ויש לבצעו מדי יום.ניתן להשלים את כיול האלקטרודה במהלך בידוד המיטוכונדריה. ראשית, הוסיפו 100 milliliters של מים מזוקקים לבקלי 250 milliliter וערבבו בחוזקה במשך 20 דקות. כדי להשריות את המים עם הגז האטמוספרי, כסו את אלקטרודת ה-GRAT בכמה טיפות של 50% potassium chloride.כעת הניחו חתיכה קטנה של נייר גלגול ריזלה (rizla) כחול על גבי האלקטרודה. לאחר מכן, הניחו חתיכה של ממבנה PTFE על גבי נייר הגלגול.החילו את הטבעת הפנימית באמצעות applicator הטבעות, ולאחר מכן מקמו את הטבעת החיצונית בחריץ האלקטרודה. חברו את האלקטרודות והרכיבו את בסיס טבעת הפלסטיק הגדולה, את תא המיטוכונדריה ואת צינורות המים. הפעילו את תיבות ה-GRAT והפעילו את תוכנת ה-GRAS.הוסיפו את המים שעברו שיווי משקל לתא המיטוכונדריאלי. לאחר מכן הוסיפו מגנט ערבוב והפעילו את מערכת הערבוב. לחצו על hardware.לאחר מכן, ערבבו במהירות. כווןו את המהירות ל-60 ולחצו על "on". לאחר מכן, התחילו ניסוי חדש.לחצו על calibrate ולאחר מכן על liquid phase calibration. עבור תיבה אחת, שנו את הטמפרטורה ל-37 °C ולחצו על okay פעמיים. כאשר override ישנה ל-okay, לחצו עליו ופתחו את מיכל הגז חנקן.הכנס את הקצה המחובר למכל החנקן אל תוך התא והשג רמה אפסית של חמצן. לחץ על אישור כאשר המערכת תעבור ממצב override. שאב את המים והוסף 500 µL של EB לתאי המיטוכונדריה.אטמו את התא באמצעות בוכנה. אם אתם משתמשים במספר קופסאות, חזרו על שלב הכיול עבור כל קופסה. התחילו ניסוי חדש והמתינו כדקה.כדי לייצב את האות, הוסיפו את הנפח הדרוש של תרחיף המיטוכונדריה כדי להגיע ל-150 micrograms בכל תא. סמנו את האירוע והניחו למערכת לפעול. למשך דקה אחת, הוסיפו 10 microliters של 250 millimolar glutamate מחומם ו-125 millimolar malate, כדי להגיע לריכוז סופי של 5 millimolar glutamate ו-2.5 millimolar malate; סמנו זאת והניחו למערכת לפעול למשך דקה אחת.זה מוגדר כמצב שני. לאחר מכן, הוסיפו 7.5 µL של 10 mM a DP לריכוז סופי של 150 µM. לאחר מכן סמנו והניחו לזה לרוץ במשך 30 שניות.מצב זה מוגדר כמצב שלושה. הוסיפו עוד 7.5 µL של ADP בריכוז 10 mM, והמתינו 1.5 דקות. הוסיפו 0.5 µL של oligomycin קר בריכוז 10 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 1 µM, והמתינו שלוש דקות.מצב זה מוגדר כמצב ארבעה. הוסיפו 1 µL של FCCP קר בריכוז 0.1 mM כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 µM, והמתינו שלוש דקות. מצב זה מוגדר כמצב חמישה.עם הסיום, הפסק את הניסוי ושמור אותו. רכוש את קצבי הנשימה באמצעות תוכנת ה-raft. הזן את פקטור הנורמליזציה.במידה ומוסיפים 150 micrograms של חלבון מיטוכונדריאלי, מקדם הנורמליזציה יהיה 0.15. חשבו את קצבי הנשימה המנורמלים עבור מצבי הנשימה השונים. חשבו את יחס הבקרה הנשימתי או ה-RCR על ידי חלוקת מצב שלושה במצב ארבע.איור זה מציג רישום מייצג של צריכת חמצן על ידי מיטוכונדריה של שריר שלד. לאחר ייצוב אות האלקטרודה, דגימת המיטוכונדריה מתווספת לתא ה-GRAT. במצב שני, הנשימה מתחילה עם הוספת גלוטמט ומאלט.הוספה של ADP מגבירה את צריכת החמצן. הגדרה של מצב 3. נשימה; ATP syntase נחסם על ידי הוספת oligomycin כדי להגיע לנשימה במצב 4.לבסוף, מוסיפים FCCP כדי לבצע ביטול צימוד (uncoupling) של הנשימה המיטוכונדריאלית. תרשים זה מציג שיעורי צריכת חמצן מייצגים עבור מצבים 2, 3, 4 וחמש. עבור כל ניסוי מחושב יחס הבקרה הנשימתית או RCR.RCR הגבוה מ-4 נחשב לעדות להכנה חיונית של מיטוכונדריה. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור את דגימות המיטוכונדריה בקרח בכל עת. לאחר ביצוע פרוצדורה זו.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Western blots, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תכולת חלבונים מיטוכונדריאליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד מיטוכונדריה משריר שלד, כמו גם של נשימה מיטוכונדריאלית.

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כאן, דגימת שריר ארבע ראשי נלקחת מחזיר מורדם והמיטוכונדריה מבודדת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, קצב הנשימה של מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית I, II ו-IV נקבעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

טיהור אבות מן שרירי השלד

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

למדו לבודד מיטוכונדריות משלד ולמדוד נשימה מיטוכונדריאלית בשיטת פוליגרפיה. פרוטוקול זה מאפשר הערכת פונקציה מיטוכונדריאלית באמצעות ניתוח צריכת חמצן במצבי נשימה שונים.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

גלה סרטונים נוספים