Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample
JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:32 דק' • July 1st, 2026
Take a soil extract containing bacteriophages, including Arthrobacter phages, pre-mixed with a growth medium.
Add Arthrobacter bacteria and incubate under agitation.
Arthrobacter phages attach to the bacterial surface and inject their DNA to produce new phages.
The host cells lyse to release progeny phages, enriching the medium with Arthrobacter phages.
Dilute this medium to reduce the phage concentration.
Add fresh Arthrobacter cells and calcium ions, which aid in phage infection.
Mix with a soft agar and pour onto a nutrient agar plate. The solidifying soft agar immobilizes the bacteria and restricts the phage spread.
Upon incubation, each phage infects a nearby host cell. It then produces progeny phages that infect neighboring bacteria, allowing localized infection.
The uninfected bacterial cells grow, while the infected bacterial cells lyse, detected as clear zones called plaques over a bacterial lawn.
These plaques contain progeny phages, ready for downstream use.
Begin this procedure by adding 1 to 2.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture to each of the flasks containing filter sterilized LB soil extract mixture. If the OD 600 of the culture is 0.5 to 0.7, use 1 milliliter. If the OD600 is higher than 0.7, use 2.5 milliliters.
Shake the flasks at 250 RPM at 30 degrees Celsius for approximately 24 hours in a shaking incubator. After the 24 hour incubation period, remove the enrichment flasks from the shaking incubator. Dilute the enrichment samples tenfold in phage buffer.
Set up culture tubes with 0.5 milliliters of late exponential or early stationary phase bacteria culture. Add various amounts from 5 microliters to 500 microliters of the diluted enrichment culture to the culture tubes.
Add calcium chloride to the culture tubes to make a final concentration in 5 milliliters equal to the concentration present in the original enrichment flask. Use a range of different calcium chloride concentrations to select for many phages with varying calcium chloride dependencies. Add 4.5 milliliters of LB top agar to each culture tube, and pour the mixture onto an LB agar plate.
Swirl gently to distribute evenly across the plate and allow the top agar to solidify for approximately 15 minutes. Invert the plates and incubate at 30 degrees Celsius overnight to 48 hours. Vary the incubation times to optimize for the phages present.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת העשרה אופטימלית לבידוד מיני בקטריאופאגים של Arthrobacter מדגימות קרקע. הפרוטוקול משלב שיטות של תרבית העשרה ובדיקת פלאקים (plaque assay) כדי להגביר, לזהות ולבודד פאגים, המזוהים כ a-זוני ליזיס (lysis zones) ברורים על פני מדשאה בקטריאלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- מחקר בבקטריופאגים
- וירולוגיה סביבתית
רקע
- בקטריופאגים הם וירוסים המדביקים חיידקים, וממלאים תפקידים מרכזיים באקולוגיה מיקרובית.
- מיני Arthrobacter הם חיידקי קרקע נפוצים והם חשובים למחקרים סביבתיים.
- בידוד פאגים מדגימות סביבתיות דורש טכניקות יעילות להעשרה ולגילוי.
- בדיקות פלאקים (Plaque assays) הן הסטנדרט להדמיה וכמותיות של פעילות פאגים.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של העשרה ובידוד של פאגים של Arthrobacter מדגימות קרקע.
- להדגמה של פרוטוקול הדיר עקבי להגברה וזיהוי של פאגים באמצעות בדיקות פלאקים (plaque assays).
- לסייע ביישומים המשכיים הכוללים פאגים מבודדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמצית קרקע המכילה בקטריאופאגים וערבובה עם מדיום גידול.
- הוספת חיידקי Arthrobacter ודגירה תחת ערבול בטמפרטורה של 30°C למשך 24 שעות.
- דילול של המדיום המועשר והוספת תאים בקטריאליים טריים וסידן כלוריד.
- ערבוב עם אגר רך ומזיגה על צלחות אגר רגזני (nutrient agar) לצורך ביצוע בדיקת פלאקים (plaque assay).
- דגירה של הצלחות כדי לאפשר זיהום על ידי הפאג ויצירת פלאקים.
תוצאות עיקריות
- העשרה והגברה מוצלחות של פאגים של Arthrobacter מדגימות קרקע.
- היווצרות פלאקים (plaques) ברורים על משטחי חיידקים, המעידים על ליזיס מקומית הנגרמת על ידי הפאג.
- אופטימיזציה של ריכוזי סידן כלורי כדי לבחור פאגים בעלי תלות משתנה.
- בידוד פאגי צאצאים מפלאקים לצורך מחקר נוסף.
מסקנות
- פרוטוקול ההעשרה ובדיקת הפלאקים המותאם ביעילות מבודד פאגים של Arthrobacter מהקרקע.
- התאמת צפיפות תרבית החיידקים וריכוז הכסלcium chloride משפרת את התאוששות הפאגים.
- שיטה זו תומכת ביישומים המשכיים בביולוגיה של פאגים ובמיקרוביולוגיה סביבתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בידוד יעיל של בקטריופאגים של Arthrobacter מדגימות סביבתיות מאפשר פיתוח של כלים ביולוגיים חסונים למחקר מיקרוביאלי וליישומים בביוטכנולוגיה. תהליך העשרה ובדיקת פלאקים (plaque assay) מספק בסיס הניתן לשחזור ליצירת מאגרי פאגים מאופיינים היטב, התומכים בגילוי מוקדם ובפיתוח בדיקות במחקר ופיתוח של ביו-פארמה. יכולת זו היא קריטית לקידום טכנולוגיות מבוססות בקטריופאגים ולהפחתת סיכונים בתהליכי תיקוף של מטרות מיקרוביאליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של אינטראקציות בין בקטריופאג למארח לצורך תיקוף מטרות מיקרוביאליות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי בידוד פאג'ים בעל ספציפיות מארח מוגדרת.
- מסייע בביסוס ביטחון תחזיתי במחקרים המשכיים של ביולוגיה של פאג'ים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מייצר מלאי פאג'ים מתוקף עבור בדיקות פלאק (plaque assays) סטנדרטיות.
- מספק קריאות פלאק כמותיות וניתנות לשחזור לצורך אופטימיזציה של הבדיקה.
- תומך בתהליכי עבודה ניתנים להרחבה לסריקת אינטראקציות פאג'-חיידק.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר רצף החל מבידוד פאגים מהסביבה ועד לפיתוח מודל פרה-קליני במידת הצורך.
- תומך בקידום מותאם-סיכונים של מועמדי פאגים לאפיון מעמיק יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לפיתוח הבדיקה, ומספקת מאגרי פאגים בסיסיים ותוצאות כמותיות עבור סריקות ומחקרי מנגנון עוקבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות הנוגעות לספציפיות של פאג-מארח ולדינמיקה של זיהום.
- סריקה: מספקת בדיקות פלאק (plaque assays) הניתנות לשחזור לצורך הערכה השוואתית של פעילות הפאגים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של אזורי ליסיס להשוואת יכולת ההדבקה של הפאגים.
- מחקר תרגומי: מניחה את התשתית לקידום מועמדי פאגים להערכה פרה-קלינית כאשר הדבר נתמך על ידי נתונים נוספים.
- שימוש חוזר בארגון: קובעת פרוטוקול סטנדרטי לבידוד ואפיון חוזרים של פאגים סביבתיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת פאג'ים ובתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי העשרה ובדיקות פלאק (plaque assay) להבטחת שחזוריות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go לקידום מועמדי פאג'ים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של יוזמות מחקר מבוססות פאג'ים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה ובביולוגיה של פאג'ים.
- נדרשת גישה למדגרי ניעור, ספקטרופוטומטרים ותשתיות לטכניקה סטרילית.
- דורש סטנדרטיזציה של תנאי בדיקת פלאקים (plaque assay) בין צוותים השונים לצורך הדירות (reproducibility).
- עשוי לדרוש התאמה של פרמטרי ההעשרה עבור דגימות סביבתיות שונות או מאחים בקטריאליים שונים.
- תלוי באופטימיזציה של ריכוזי calcium chloride וזמני דגירה להשגת השבה מקסימלית של פאג'ים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
הבנת ההשפעה של בקטריופאג'ים ממוזגים על הליזוגנים שלהם באמצעות שעתוק
סרטונים קשורים
0 צפיות
אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo
סרטונים קשורים
0 צפיות
הסרת בקטריופאג' מתרביות סלמונלה נגועות
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים לאנליזה מולקולרית
סרטונים קשורים
0 צפיות
הכנת תרבית חיידקים בקרקע לזיהום בקטריופאג'
סרטונים קשורים
0 צפיות
Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample
סרטונים קשורים
0 צפיות
טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית
סרטונים קשורים
0 צפיות
ביו-פרוספקציה של מיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים לטיפול בזיהום סביבתי
סרטונים קשורים
0 צפיות
בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026