Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production
JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:26 דק' • July 31st, 2026
Begin with wells containing adherent mammalian cells co-transfected with plasmids encoding viral proteins and either a non-inhibitory control RNA or an inhibitory RNA.
In the control wells, viral proteins, including reverse transcriptase (RT), assemble into mature virus-like particles (VLPs) and are released into the supernatant.
In the test wells, the inhibitory RNA suppresses viral protein expression, reducing VLP production.
Transfer the supernatant to a lysis buffer and incubate to lyse the VLPs, releasing RT.
Add a buffer containing radiolabeled nucleotides, primers, a synthetic RNA template, and cofactors, then incubate.
The RT incorporates the labeled nucleotides into new strands.
Spot the mixture onto a charged filter paper, dry it, and wash with a buffer to remove unbound nucleotides.
Perform an alcohol wash to remove residual salts.
Measure radioactivity to quantify RT activity, indicating VLP production.
Reduced VLP production in test samples indicates suppression by the inhibitory RNA.
To carry out the viral production assay, after removing the 24-well cell culture plates from the incubator, transfer them to the BSL-3 cell culture hood. Gently swirl the plates and then transfer 150 microliters of the supernatant from each well to a corresponding well in a 96-well flat-bottom plate to be used to quantify HIV-1 production. Transfer 5 microliters of supernatant to the corresponding wells in a 96-well plate containing 25 microliters of a viral disruption cocktail.
After incubating the mixture for five minutes at room temperature, transfer the plate to a radioactivity work station. Next, prepare a radioactive cocktail, and add 25 microliters to each well of viral supernatant and disruption cocktail. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for two hours.
Spot 5 microliters of the reaction mixture onto corresponding squares in a glass fiber DEAE filter mat paper, and allow the spots to dry for 10 minutes. Use 2x SSC buffer to wash the papers five times for five minutes each, followed by two one-minute washes with 95% ethanol. Allow the papers to dry before sealing them in sample bags.
Clip sample bags containing the filter mat paper into a cassette, and insert the cassette into a microplate scintillation counter. Then start the counter. For any viral quantification method, divide the values obtained for each test RNA by the adjacent negative control and multiply this value by 100 to get the percent inhibition of HIV-1 production for each replicate of the test RNAs.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת היעילות והרעילות של RNA שנועדו לעכב את ייצור HIV-1, תוך שימוש במבחן טרנסקריפטאזה הפוכה (RT) כמדד כמותי לפלט של חלקיקים דמויי נגיף (VLP). השיטה כוללת טרנספקציה משותפת של תאי יונקים עם פלסמידים ו-RNA לבדיקה, ולאחריה מדידה של פעילות RT בנוזל העילאי כדי להעריך את הדיכוי של ביטוי הגנים הנגיפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה מולקולרית
- וירולוגיה
- מחקר בטיפול גנטי
רקע
- ניתן לדכא את ייצור HIV-1 באמצעות RNA מעכב המכוון לביטוי גנים ויראליים.
- פעילות של טרנסקריפטז 역ו (Reverse transcriptase) משמשת כסמן חלופי לייצור VLP.
- בדיקות RT כמותיות מאפשרות להעריך את היעילות האנטי-ויראלית in vitro.
- מדידה מהימנה של תפוקת VLP חיונית להערכת מועמדים ל-RNA טיפולי.
מטרת המחקר
- להעריך את יכולתם של ה-RNAs הנבדקים לעכב את ייצור HIV-1 בתאי יונקים.
- לספק שיטה כמותית למדידת תפוקת VLP באמצעות פעילות RT.
- לבסס פרוטוקול המתאים לסריקה של טיפולים תרופתיים או גנטיים מבוססי RNA המכוונים ל-HIV-1.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה משותפת (Co-transfection) של תאי יונקים דבקים עם פלסמידים המקודדים לחלבוני HIV-1 ועם RNA מעכב או RNA בקרה.
- איסוף של העלייה (supernatant) המכילה VLPs משוחררים.
- ליזיס של ה-VLPs לשחרור אנזים ה-RT.
- דגירה עם נוקלאוטידים מסומנים רדיואקטיבית, פריימרים ותבנית RNA סינתטית כדי לאפשר שילוב נוקלאוטידים בתיווך RT.
- הנחת תערובות תגובה על נייר מסנן טעון, ולאחריהם שטיפות עקביות של בופר ואתנול.
- מדידת רדיואקטיביות באמצעות מונה סינפילציה (scintillation counter) לכימות פעילות ה-RT.
- חישוב אחוז העכבה על ידי השוואת דגימות RNA לבדיקה מול בקרות שליליות.
תוצאות עיקריות
- RNA מעכבים מפחיתים את פעילות ה-RT בנוזל העל, דבר המעיד על ירידה בייצור VLP.
- RNA בקרה אינם מדכאים את פעילות ה-RT, מה שמאשר את סגוליות הבדיקה.
- הפרוטוקול מאפשר השוואה כמותית של מבני RNA שונים ביכולתם לעכב את ייצור HIV-1.
- ערכי אחוזי עיכוב מספקים מדד סטנדרטי להערכת היעילות.
מסקנות
- בדיקת ה-RT היא שיטה יעילה וכמותית להערכת הדיכוי של ייצור HIV-1 על ידי RNA מועמד.
- פרוטוקול זה מתאים לסריקת טיפולים מבוססי RNA המכוונים ל-HIV-1.
- כימות מהימן של תפוקת ה-VLP מסייע בפיתוח טיפולים גנטיים או תרופתיים נגד HIV-1.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות כמותיות של טרנסקריפטאז הפוך (RT) מספקות מדד חסון וניתן להרחבה להערכת היעילות של התערבויות מבוססות RNA המכוונות לייצור HIV-1. גישה זו מאפשרת תיקוף של מטרות בשלב מוקדם והפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור עיכוב מולקולרי לדיכוי תפקודי של פלט חלקיקי דמויי נגיף (VLP). השיטה תומכת במיון תיקי פיתוח ובתעדוף של טיפולים גנטיים או תרופתיים מועמדים במסלולי גילוי של תרופות נוגדות נגיפים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של היפותזות טיפוליות המכוונות לביטוי גנים ויראליים.
- מספק תיקוף תפקודי של RNA מעכב באמצעות מדידה כמותית של תפוקת VLP.
- תומך בהורדת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעתו של ה-RNA הנבדק על הרכבת חלבונים ויראליים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מועמדים לפיתוח נוסף.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקה סטנדרטית וניתנת לשחזור לסריקה בשרירה גבוהה (high-throughput screening) של מבני RNA.
- מייצר נתונים כמותיים של פעילות RT להשוואת יעילות בין מספר מועמדים.
- מבטיח מוכנות של הבדיקה להערכת תרכובות בשלבים הבאים וליכולת הרחבה (scalability) של הפלטפורמה.
- תומך בביצוע השוואה (benchmarking) מהימנה של עוצמה מעכבת במערכת מבוקרת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם את הדיכוי של ייצור VLP ב-in vitro עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- מספק רציפות מגילוי מולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנונים אנטי-ויראליים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות סיכון המבוססות על מדדי עיכוב כמותיים.
- מחזק את הערך הניבוי למחקרים הבאים ב-in vivo או למחקרי קליניקה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוססת על RT, נטמעת ברצף המוקדם של תהליך הגילוי ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובכך היא מגשרת בין תכנון מולקולרי לבין תיקוף פרה-קליני עבור מועמדים לתרופות אנטי-ויראליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי כימות ההשפעה של RNA מעכב על תפוקת VLP.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך תיעוד עדיפויות של מועמדים וסטנדרטיזציה של בדיקות.
- אנליטיקה: מספק מדדי אחוזי עיכוב לצורך השוואה בין תנאים שונים וניתוח סטטיסטי.
- מחקר תרגומי: מסייע בהלימה עם נקודות קצה של דיכוי הרלוונטיות למחלה לצורך קידום פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה להערכת אסטרטגיות אנטי-ויראליות מגוונות המבוססות על RNA.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי סינון אנטי-ויראליים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים כמותיים על יעילות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מועמדים אנטי-ויראליים בעלי רמת ביטחון גבוהה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בוירולוגיה מולקולרית וביצוע בדיקות כמותיות.
- נדרשת גישה לתשתית לטיפול בחומרים רדיואקטיביים ומכשור לספירת סינטילציה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של הגדרות הבדיקה ושל פרוטוקולי ניתוח הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למערכות ויראליות שונות או למודליות RNA שונות.
- כולל אמצעי זהירות של רמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) לטיפול ברכיבים ויראליים.
שאלות נפוצות בביופארמה
ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס
סרטונים קשורים
0 צפיות
3'-Termini הקובע ורצפים של מולקולות Nascent חד גדילי ה-DNA הנגיפי במהלך HIV-1 הפוך שעתוק בתאים נגועים
סרטונים קשורים
0 צפיות
זיהוי של וירוס הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) Antisense חלבון (ASP) תעתיקים בחולים על ידי סטרנד ספציפי-PCR
סרטונים קשורים
0 צפיות
הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה
סרטונים קשורים
0 צפיות
שחזור הפוך גנטיקה מתווכת של norovirus Murine זיהומיות
סרטונים קשורים
0 צפיות
וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים
סרטונים קשורים
0 צפיות
הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג'ין או טיפול תרופתי
סרטונים קשורים
0 צפיות
גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי
סרטונים קשורים
0 צפיות
מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת
סרטונים קשורים
0 צפיות
הפקה של חלקיקים Pseudotyped ללמוד מעוררת פתוגני באווירה אבטחה ברמה 2
סרטונים קשורים
0 צפיות
עודכן לאחרונה: 29 אוגוסט 2026