ייצור פסאודו-וירוס באמצעות טרנספקציה של פלסמיד בתאים אנושיים

התחל עם בקבוק תרבית המכיל תאי כליה עובריים אנושיים בתווך עשיר בחומרי הזנה.

החלף את המצע במצע טרי המכיל chloroquine כדי לשפר את העברת הפלסמיד לתאים.

קחו תערובת של פלסמידים המקודדים לחלבוני שטח של שפעת, חלבונים גרעיניים של לנטי-וירוס, ואת הגנום הלנטי-ויראלי, יחד עם סידן פוספט. דגרו את התערובת ליצירת קומפלקסים של סידן פוספט–DNA.

הוסיפו את התערובת לתאים וערבבו בעדינות. דגרו כדי לאפשר לקומפלקס להיכנס לתאים באמצעות אנדוציטוזה. כלורוקווין מעודד בריחה מהאנדוזום של ה-plasmid DNA.

בתוך התא, ה-plasmid DNA מניע את הביטוי של מרכיבי השפעת והלנטי-וירוס כאחד.

החליפו את המצע כדי להסיר קומפלקסים עודפים.

דגרו את התאים כדי לאפשר לרכיבי הנגיף להתרכב ולהנצץ כפסאודו-נגיפים, אשר משתחררים אל מצע התרבית.

אסוף את המדיום המכיל את הפסאודו-וירוסים וסבב בצנטריפוגה כדי לשקיע את השאריות התאיות.

אסוף את העלייה (supernatant) המכילה את הפסאודו-וירוס ואחסן אותה בטמפרטורות נמוכות עבור בדיקות המשך.

ראשית, הכינו תרחיף של תאי HEK 293FT בתמיסת DMEM מלאה. הוסיפו 10 mL מהתרחיף לבקבוק T75, ולאחר מכן דגרו בטמפרטורה של 37 °C.

שעתיים לפני הטרנספקציה, החליפו את המצע הישן בעשרה מיליליטר של מצע מלא טרי המכיל chloroquine. ערבבו את הרכיבים ואת ה-plasmid DNA כפי שמתואר במאמר. לאחר מכן, העבירו תערובת זו אל המצע מעל התאים ונערנעו בעדינות.

לאחר הדגירה, החליפו את המצע ב-15 mL של מצע DMEM מלא וטרי. לאחר שישים וחמש שעות, אספו את העלייה (supernatant) באמצעות סבב צנטריפוגה. אספו את העלייה וחלקו אותה לאליקוטים.