אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:54 דק׳ • August 31st, 2026
קחו עין שהוצאה ממודל עכבר של מחסום רשתית פגום, שהוזרק מראש בנגיף adeno-associated virus הנושא את הגן של החלבון הפלואורסצנטי הירוק.
מחסום הרשתინა המופר מאפשר ל-AAV לחדור לתאי פוטורצפטורים, שם הגנום הוויראלי מובע כדי להפיק GFP, ובכך הופך את התאים לפלוורסצנטיים.
בצעו דיסקציה של העין כדי להסיר את קרנית העין ואת העדשה, תוך השארת גביע העין שלם.
טבול את כוס העין (eyecup) בתמיסת קיבוע כדי לשמר את מבנה הרשתית.
העבירו את גביע העין באופן רצופי דרך ריכוזים עולים של תמיסות קריו-פרוטקטור (cryoprotectant). לאחר מכן, גרעו בריכוז הסופי כדי למנוע היווצרות גבישי קרח.
טמיעו את כוס העין במדיום קריוגני והקפיאו אותה.
בעזרת קריוסטט, חתוך את כוס העין לפרוסות דקות.
העבירו את החיתוך על גבי סרטית. הוסיפו באפר המכיל דטרגנטים כדי להחדיר את הרקמה (permeabilize) ולאפשר גישה לנוגדנים במהלך הצביעה האימונוהיסטוכימית העוקבת.
שטפו את הפלח. טפלו בו בתמיסת חסימה כדי למנוע אינטראקציות לא ספציפיות של נוגדנים במהלך הצביעה האימונוהיסטוכימית.
חתך הרשתית בהקפאה מוכן להמשך הליכי צביעה אימונוהיסטוכימית ודימוי פלואורסצנטי. תאים פלואורסצנטיים חיוביים ל-GFP מעידים על טרנסדוקציה ויראלית מוצלחת, המצביעה על חדירות הרשתית.
לאחר הוצאת העיניים מבעל חיים מוזרק שהורג (euthanized), נתחו את העיניים להסרת העדשה והקרנית. לאחר מכן, בצעו קיבוע בטבילה (immersion-fix) של העין המנותחת ב-4% paraformaldehyde למשך שעה. לאחר שעה, בצעו הגנה קריוגנית (cryo protect) לעיניים ב-10% sucrose למשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השרו את העיניים ב-20% sucrose למשך שליש שעה בטמפרטורת החדר.
לבסוף, השאירו את העיניים בתמיסת סוכרוז 30% למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, הטמיעו והקפיאו את כוסי העין (eyecups) בשרף להטמעה כגון Cryo-matrix. לאחר מכן, באמצעות קריוסטט, הכינו חתכים של 10 µm והצמידו אותם לשקופיות המיועדות לרקמות קפואות.
כעת בצעו פרמיאביליזציה של החתכים על השקופיות באמצעות דטרגנט למשך חמש דקות. לאחר מכן, בצעו שני שטיפות קצרות ב-PBS. לאחר מכן, חסמו את העיניים למשך שעה בטמפרטורת החדר.