JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:24 דק' • August 31st, 2026
התחילו עם עין של עכבר טרנסגני שהוזרק בעבר עם וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) הנושא את הגן הרלוונטי המקודד לחלבון פלואורסצנטי.
בעכבר חסר גן החיוני לשמירה על שלמות ממברנת הגבול הפנימית (ILM), מחסום המפריד בין הרשתית לבין חלל הזגוגית.
אובדן של גן זה מחקה דגנרציה רטינאית, מה שמאפשר לנגיף לחדור עמוק יותר אל תוך שכבות התאים של הרשתית.
תאי רשתית נגועים מבטאים את הגן הנחקר ומייצרים חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר להם להפגין פלואורסצנציה.
כעת, בצעו דיסקציה לעין והסִירו את הקרנייה ואת העדשה.
הפרידו בזהירות את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית (RPE) ומהסקלרה, השכבה החיצונית של העין.
טבול את הרקמה במקבע.
שטוף עם בופר פוספט כדי להסיר שאריות של מקבע.
בבחינה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי, פלואורסצנציה בתאי הרשתית מעידה על חדירה ויראלית מוצלחת דרך הקרום המגביל הפנימי הפגוע.
עבור דגימות רשתית שטוחות (flat mounts), הקל את הדיסקציה על ידי קיבוע העיניים שהוצאו (enucleated) ב-4% paraformaldehyde למשך 15 עד 30 דקות. קיבוע זה והקיבוע שלאחר הדיסקציה חייבים להתבצע כראוי, שכן הם קריטיים לשימור הפלואורסצנציה של ה-GFP. בתוך 15 עד 30 דקות של תקופת הקיבוע, בצע דיסקציה לעיניים והסר את הקרנית ואת העדשה.
הפרידו את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית ומהסקלרה על ידי חיתוך מסביב ל-ora serrata ולעצב האופטי. לאחר הניתוח, טבלו את הרשתית ב-4% paraformaldehyde למשך 30 דקות נוספות כדי לקבע את הרקמה ואת החלבון הפלואורסצנטי בתאי רשתית שעברו טרנסדוקציה. לאחר הקיבוע, שטפו את הדגימה במשך חמש דקות ב-PBS סטרילי ב-pH 7.4.