JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:24 דק' • August 31st, 2026
קחו מבחנות המכילות קפסידים ויראליים, שהם חלקיקים דמויי נגיף ללא חומר גנטי.
חממו את המבחנות בטמפרטורה קבועה למשכי זמן משתנים.
משך חימום קצר יותר גורם למאמץ קל של חלבוני הקפסיד, בעוד שחימום ממושך משבש את הקפסיד וגורם לאגרגציה.
קררו את המבחנות במהירות כדי למנוע שינויים מבניים נוספים.
העבירו את הנוזל אל סרט פאראפין.
הניחו רשת למיקרוסקופיה אלקטרוניתית למשואת אלקטרונים (TEM) על גבי הטיפה. הקפסידים נצמדים לפני השטח של הרשת.
ספגו את הרשת עם נייר סינון כדי להסיר עודפי נוזל.
שטוף עם בופר להסרת קפסيدات שאינן קשורות היטב, ולאחר מכן ספוג שוב את הגריד.
טבילה ב-uranyl acetate, צבע מתכת כבדה הנקשר לפני השטח של הקפסיד, הגורם להם להיראות כהים יותר תחת TEM.
ספגו את הגריד והניחו אותו על פלטה. אחסנו את הפלטה בדסיקטור כדי להסיר לחות.
בצעו דימוי של הגריד באמצעות TEM כדי להוויזואליזציה של נזקי הקפסיד המושרים בחום.
בצע טיפול בחום כפי שנעשה קודם לכן, אך החלף את ה-10 millimolar HEPES, pH 7.4 ב-PBS, ואל תדלל את הקפסידים יותר לאחר הטיפול. לאחר מכן, העבר בפיפטה את כל טיפה של 15 microliter של תמיסת הקפסיד המטופלת אל על סרט פראפין. אחוז את קצה הרשת עם פינצטה, אפשר לה להיסגר על הקצה כדי להחזיק את הרשת, והנח את הרשת כאשר צד הפחמן פונה כלפי מטה על גבי הטיפה של התמיסה המטופלת.
השאירו את הרשת להבקיע למשך 10 דקות כדי לאפשר לקפסיד להיקשר לרשת. בהתאם לדרגת הניקיון של תכשיר הקפסיד, הוסיפו שטיפות של תמיסת HEPES בצורת טיפות של 10 עד 15 µL המונחות בקו לאחר טיפת הקפסיד המטופל. לאחר 10 דקות, הרימו את הרשת יחד עם הטיפה.
הניחו את הרשת כמעט בניצב לחתיכת נייר סינן כדי לספוג את הטיפה. לאחר מכן, השתמשו ברשת כדי להרים טיפה של 10 עד 15 µL של HEPES buffer והחזיקו אותה למשך 30 שניות. לאחר 30 שניות של זמן שטיפה, ספגו את הנוזל באמצעות חתיכת נייר סינן נוספת.
בשלב הבא, הניחו טיפה של 15 µL של תמיסת uranyl acetate בריכוז 2% על סרט הפרפין באזור פנוי. שאבו את טיפת ה-uranyl acetate בעזרת הרשת והחזיקו אותה למשך 45 s. לאחר מכן, ספגו את ה-uranyl acetate תוך הקפדה להסיר את מרבית התמיסה.
הניחו את הרשת כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה על פיסת נייר סינון, תוך הקפדה שהרשת לא תידבק ללחות שעל הפינצטה. לאחר מכן, הניחו את נייר הסינון עם הרשת עליו בתוך צלחת פטרי מזכוכית פתוחה. לאחר חזרת התהליך עבור כל הטיפולים, הניחו את חצאי צלחות הפטרי עם הרשתים בדסיקטור למשך לילה כדי שיתייבשו לפני התבוננות ב-TEM.