החדרת גנים לאורגנואידים של מעי עכבר באמצעות וקטורים לנטיביריים

התחילו עם אורגנואידים של מעי עכבר שעברו דיסוציאציה חלקית כדי להקל על טרנסדוקציה לנטיבית.

קחו את הווקטורים הלנטיביריים בתווך טרנסדוקציה.

הלנטי-וירוס נושא גן בעל עניין לצורך אינטגרציה יציבה לתוך הגנום של המאכסן.

הוסיפו את הלנטי-וירוס לבאר.

דגרו את התערובת כדי לאפשר חדירה ויראלית.

ה-RNA הויראלי עובר תעתוק הפוך ל-DNA ונשלב בתוך הגנום של המארח.

הוסף מצע גידול לאורגנואידים והעבר את התערובת למבחנה.

סבב במרכזפוגה כדי להסיר וירוסים שאינם קשורים.

ערבבו את המשקע במטריצת קרום בסיס (basement membrane matrix).

הניחו את האורגנואידים בבאר והמתינו עד שהם יתקשו.

המטריקס יוצר רשת הלוכדת את האורגנואידים ומספקת תמיכה מבנית.

הוסף מצע גידול לאורגנואידים המועשר במעכבי צמיחה כדי לתמוך בשגשוג האורגנואידים.

כתוצאה מכך מתקבלים אורגנואידים מנבטים המכילים את הגן שהועבר, אשר ניתן להשתמש בהם לניתוח תפקודי נוסף.

העבירו את האורגנואידים בכמות קטנה זו של מדיום לבאר בלוח של 48 בארות.

הוסיפו לאורגנואידים את הלנטי-וירוס בטיטר גבוה שהוכן מראש במצע טרנסדוקציה וערבבו שוב. דגרו את תערובת האורגנואידים והוירוס במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור תרביות כדי לאפשר את הטרנסדוקציה. לאחר שעה, הוסיפו מיליליטר אחד של מצע תרבית לאורגנואידים לתערובת האורגנואידים והוירוס, ערבבו שוב, והעבירו את התערובת לאنبוב מיקרו-צנטריפוגה; צנטריפוגו במהירות 850 x g למשך חמש דקות.

כדי להשקיע את האורגנואידים, הסר את הנוזל העליון ותלה את המשקע ב-20 µL של Matrigel קר. הנח את הטיפה במרכז הבאר. בלוח של 48 בארות, הדגר בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות, כדי שהטיפה תתמצק. לאחר 15 דקות, הוסף בזהירות 250 µL של מצע גידול לאורגנואידים המועשר ב-nicotinamide ובמעכבי kinase.