JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:40 דק' • August 31st, 2026
קח תרביות של תאי סרטן השד.
בצעו זיהום כפול עם שני סוגים של אדנו-וירוסים. אחד מהם נושא גן לחלבון פלואורסצנטי ירוק או GFP תחת פרומוטור פעיל באופן קבוע.
האחר מכיל גן דגל המקודד לחלבון פלואורסצנטי אדום או RFP, תחת פרומוטור המגיב ל-SMAD.
הוסיפו לתרבית הניסוי TGF-beta והדגירו.
הנגיפים נקשרים לקולטן כדי לחדור לתא המארח, מעבירים את הגנים אל הגרעין ומאפשרים את ביטוי ה-GFP.
בתאי הבדיקה, TGF-beta נקשר לקולטן שלו ומפעיל את מסלול ה-SMAD על ידי פוספורילציה של החלבונים SMAD2 ו-SMAD3.
חלבונים אלו יוצרים קומפלקס עם SMAD4.
קומפלקס זה נקשר לפרומוטור של הגן המדווח, ובכך מאפשר ביטוי של RFP בנוסף ל-GFP.
בביקורת, נתיב ה-SMAD נשאר לא פעיל, מה שמאפשר לתאים להביע GFP בלבד.
דגמו תמונות פלואורסצנטיות של תאים חיים.
נוכחותם של שני האותים מאשרת הפעלה של מסלול ה-SMAD באמצעות טרנסדוקציה כפולה של אדנווירוס.
ביום ההדבקה באדנווירוס, זרעו בבארות של פלטה בעלת 12 בארות כ-1.25 × 10⁵ תאי MDA-MB-231 ב-500 µL מ zrobi מצע גידול, כדי להגיע למסף של 35%. הדביקו את התאים בכל הבארות עם 75 µL של adenovirus-CMV-GFP ו-7.5 µL של adenovirus CAGA12-Td-Tomato כדי להגיע ל-MOI של 2,500, שמאפשר השגת 100% חיוביות להדבקה. לאחר מכן, הוסיפו TGF-beta לבאר הטיפול מיד לאחר ההדבקה באדנווירוס.
דגרו בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2 למשך 24 שעות. למחרת, דגמו תמונות של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בניגודיות פאזה (phase-contrast).