אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:36 דק׳ • August 31st, 2026
התחל עם לימפוציטים אנושיים המודבקים ב-HIV-1 על כיסוי זכוכית המורכב על עלית.
תאים אלו עברו היברידיזציה עם גששים המסמנים באופן פלורסצנטי RNA ויראלי ו-DNA פרו-ויראלי.
דגרו את התאים בתמיסת חסימה כדי למנוע קישור לא ספציפי של נוגדנים.
הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון הקפסיד של HIV-1.
דגרו כדי לאפשר לנוגדנים הראשוניים להיקשר לחלבון הקפסיד.
שטפו את התאים עם בופר כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים.
הוסיפו נוגדנים משניים המסומנים פלואורסצנטית, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.
שטפו את הנוגדנים שלא נקשרו.
הוסיפו צבע ספציפי ל-DNA לצביעת גרעיני התאים, ולאחר מכן שטפו כדי להסיר את עודפי הצבע.
השתמשו בדימות פלואורסצנציה מרובה (multiplexed fluorescence imaging) כדי לזהות בו-זמנית DNA ויראלי, RNA, חלבון וגרעיני המאכסן בצבעים נפרדים.
ויזואליזציה של תא בודד זו מאפשרת את חקר השלבים השונים של מחזור החיים של הווירוס באמצעות ויזואליזציה סימולטנית של DNA, RNA וחלבונים ויראליים בתאים נגועים.
לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית של החלבונים הרלוונטיים, לאחר השטיפה האחרונה, יש לטפל בכל זכוכית כיסוי באמצעות 200 microliters של תמיסת חסימה (blocking buffer) לדגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.
בסיום הדגירה, שפכו את תמיסת החסימה והוסיפו 200 microliters של הנוגדן הראשוני הרצוי, המדולל ב-PBS פלוס Tween 20 בתוספת 1% bovine serum albumin. לאחר דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר, שטפו את השקופיות בשתי שטיפות של 10 דקות ב-PBS פלוס Tween 20 טרי עם ניעור בכל שטיפה, לפני סימון הדגימות באמצעות נוגדן שני מתאים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסיום הדגירה, שטפו את השקופיות פעמיים עם PBS פלוס Tween 20 טרי למשך 10 דקות עם ניעור בכל שטיפה.
לאחר השטיפה השנייה, בצעו צביעת נגדית של הגרעינים באמצעות צבע גרעיני מתאים למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור.