מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות שיבוטים המבטאים צלולאז מספרייה מטגנומית. זה מושג על ידי שכפול ראשון של ספרייה מטאגנומית שנעשתה בעבר באמצעות רובוט לאחר הדגירה של הספרייה המשוכפלת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. הצמיחה של שיבוטי ה-e coli נמדדת, ליזה, חיץ ומצע מתווספים לאחר מכן לספרייה המשוכפלת.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המציגות את פעילות הצלולאז באמצעות מדידות ספיגה קולומטריות באמצעות קורא צלחות. היי, אני קית' מהמעבדה של סטיבן האלאם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. היום נראה לך נוהל להקרנה פונקציונלית בתפוקה גבוהה של ספריות מטאגנומיות.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את פעילות הצלולאז של ביומין מספריות מטגנומיות. אז בואו נתחיל. לפני שתתחיל בפרוטוקול זה, הכן ספרייה מטאגנומית המאוחסנת בפורמט צלחת באר 384

מחקר זה השתמש בווקטור SMID בקרת העתקה אחד PCC בשילוב עם Farge T אחד עמיד TRANSFECT max EPI 300 T תאי אי קולי עמידים אחד כמארח הספרייה כדי להתחיל בהליך זה, להסיר את הלוחות המכילים את הספרייה ממינוס 80 מעלות צלזיוס ולהפשיר אותם ב-37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות. בינתיים, השתמש בתכונת עיקור אור UV ב-QIX 2 כדי לעקר את הרובוט למשך 15 דקות. הגדר את ה-Q fill 3 לפי הוראות היצרן כאשר בקבוק המדיה מחובר לסעפת באמצעות תוכנית הצינורות הסטרילית.

ה-Q ממלא שלוש עבור כמות המדיה המתאימה ומגדיר אותה למילוי נפח של 45 מיקרוליטר. בכל אחד מהם, נקה היטב את האוויר מהצינור והסעפת באמצעות תכונת הטיהור של הרובוט עד שהמדיה נראית לעין. בכל סיכה של הסעפת, מלא את מספר הלוחות הרצוי במדיה LB באמצעות ה-Q fill שלוש.

לכל צלחת לוקח כ-20 שניות למלא. לאחר מכן, טען את צלחות הספרייה והצלחות הטריות לאזורים המתאימים של בחירת Q. לרובוט למלא את אמבטיות הניקוי בריאגנטים המתאימים.

2% מיקרו 90 באמבטיה האחורית, מים מזוקקים בחיטוי באמבטיה האמצעית ו-80% אתנול באמבטיה הקדמית. באמצעות תוכנית השכפול של ה-qix two, בחר את הראש המתאים וכן את המספר והסוגים של לוחות המקור והיעד כאחד. הגדר גם את הראש לניקוי בין שכפולים.

בדרך כלל מספיקים שישה מחזורים בכל אמבטיה. קיבולת המכונה היא 10 צלחות בכל פעם. הגדר את המכונה לפעולה.

ייקח בערך 15 דקות לשכפל אותו. קיבולת מלאה עם ראש 384 פינים. לאחר שכפול הצלחות, גדלו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בקופסת לחות.

זמן הדגירה הארוך הכרחי מכיוון שמספר עותקים גבוה של smid מושרה בתוספת ארבינוז. בינתיים, נקה את הרובוט Q fill Three כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הדגירה, הסר את הצלחות מהחממה של 37 מעלות צלזיוס.

הניחו בצד את המכסים והניחו את הצלחות על פלטפורמת טעינת המגזין המסופקת עם הערימה המהירה. הקפד לעקוב אחר סדר הלוחות מכיוון שהתוכנה לא. הלוחות בתחתית הערימה ייקראו.

ראשית, הסר מחסנית אחת מהערימה המהירה. ודא שהוא ריק ודחף אותו אל ערימת הצלחות לקריאה. תפוס את המגזין בידית והצלחת אמורה להיטען לתוך המחסנית.

טען את המחסנית לערימה המהירה בכיוון הנכון. פתח את התוכנית מחדש של הסריקה במחשב המחובר. בחר הפעלה חדשה ותן לה שם מתאים.

בחר לקרוא לתחתית שטוחה 384 צלחת באר כצלחת. הקלד באזור פריסת הצלחת. בחר בלחצן האשף ובחר בו כדי להוסיף 384 אלמונים לצלחת.

באזור הפרוטוקול, בחר באפשרות לולאת הבאר והזן עבור 384 בארות. סמל לולאת באר יופיע בעץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחר את הסמל ולחץ כדי להוסיף מדידה פוטומטרית.

הגדר אותו לקריאה של 600 ננומטר. שמור את הפרוטוקול בשם ייחודי וסגור את הסריקה את התוכנית מחדש שלו. לאחר מכן פתח את תוכנית polara RS.

בעמוד הראשי יש טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים להתקן המחסנית המהירה תחת הכותרת סריקת VARI, לחץ על אפשרות ההפעלה לאחר מכן חלון הבדיקה אמור להופיע עם תרשים זרימה באמצע. בחר את פריט הפעלת ההפעלה ולאחר מכן חפש את שם הסריקה שנשמרה.

הפעלתו מחדש בתפריט הנפתח שמופיע בצד ימין של המסך. לאחר בחירת הפרוטוקול, לחץ על הפעל. בבדיקה זו תופיע תיבה שתשאל באיזה מגזין להשתמש כמקור ואיזה מגזין ריק.

התיבה התחתונה על המסך תואמת את המגזין הקדמי. ודא שגם הערימה המהירה וגם סריקת Vario מופעלות ולחץ על התחל. הערימה המהירה תטען אוטומטית את הלוחות לקורא הצלחות ותאפשר מדידות רציפות של הלוחות.

שים לב לטעינת הצלחת הראשונה לסריקת Vario כדי להבטיח יישור נכון של המכונות לקריאה. 25 צלחות לוקחות כ-50 דקות. לאחר סיום סריקת Barrios, הסר את המחסנית המלאה והנח אותה על פלטפורמת טעינת המחסנית.

הרם את המלבן החיצוני של הפלטפורמה והמחסנית צריכה להחליק, ולהשאיר את הצלחות עומדות בערימה באמצע. לבסוף, החזר את המכסים על הצלחות למסך מבוסס פתרון. לפעילות תאית תחילה, הכינו את תערובת הבדיקה באמצעות מלאי ליזה מוכן מראש פי 10.

מערבבים פנימה מאגר אשלגן אצטט 50 מילי-מולרי ב-pH 5.5 כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן הכינו מלאי של עד 75 מיליגרם למיליליטר, מצע ביוציד של תאי DIPHENYL או DNP כרומוגני ב-DMSO, וודאו שהמצע מומס במלואו. הוסף תמיסת מלאי ביוצידים של תאי DNP לתערובת הבדיקה לריכוז סופי של 0.1 מיליגרם למיליליטר.

זכור כי כל צלחת משתמשת בכ -20 מיליליטר תמיסה ויש צורך ב -50 מיליליטר נוספים בכדי לאפשר נפח מת. הגדר את מילוי ה-Q שלוש כמו קודם בתערובת הבדיקה לכל צלחת באמצעות מילוי Q שלוש. לכל צלחת לוקח כ-20 שניות למלא.

לאחר הוספת תערובת הבדיקה, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 16 שעות. בקופסת לחות, הסר את הצלחות מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. הניחו בצד את המכסים והניחו את הצלחות על פלטפורמת טעינת המגזין המסופקת עם הערימה המהירה באותו אופן כמו קודם.

פתח את התוכנית מחדש של הסריקה והגדר אותה כפי שנעשה קודם לכן למעט המדידה הפוטומטרית, שאמורה להיות מוגדרת לקריאה של 400 ננומטר. לאחר מכן הזן את הפרמטרים לתוכנית POLARA RS. כפי שהודגם קודם לכן.

אפשר לסריקת Vario לקרוא את הלוחות. לאחר הריצה, הסר והשליך את הצלחות. כדי לייצא את קריאות הספיגה פתוחות, סרוק אותה מחדש ובחר.

פתח קובץ קיים. בחר את הספרייה שבה נשמרה ההפעלה ולחץ על סמל הפלוס כדי להרחיב את הרשימה. תחת כותרת הכותרת יופיעו אפשרויות המסומנות מיכל אחד למיכל N.בהתאם למספר הלוחות, בחר את הצלחת הראשונה לניתוח בשורת התפריטים בראש הדף, בחר ייצוא דוח נתונים.

בחרו אפשרויות ייצוא, כגון פריסת לוחית ונתונים פוטומטריים. לחצו על 'הצג דוח' ולאחר מכן על 'שמור קובץ'. בחר את הספרייה הרצויה.

פורמט הפלט הוא גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel. כאן, קריאות ספיגה מ-384 יחיד. צלחת באר המכילה שיבוט חיובי כפי שמוצג שיבוטים חיוביים מראים עלייה ניכרת בספיגה בהשוואה לשיבוטים שאינם מבטאים פעילות צלולאז.

הבדלים בזמן הבדיקה, ובכן, המיקום על הצלחת או ריכוז ה-DNP יכולים להשפיע על קריאות הספיגה המוחלטות. קריאות ספיגה יחסיות כגון ההבדל בספיגה מעל ממוצע הצלחת או ממוצע העמודה הן שיטה חזקה יותר לזיהוי שיבוטים חיוביים לצלולאז. זה עתה הראינו לך כיצד לזהות שיבוטים חיוביים לצלולאז מספרייה מטגנומית.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להמיס את הצד הביולוגי של תאי ה-DNP שלך ב-DMSO ולדגור את הצלחות שלך בתא לחות. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.