Name: מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: למדו שיטת סקרון גבוהה-תפוקה לזיהוי קלונים מבטאי צלולאז מספריית מטגנומיקה ב-Escherichia coli. השיטה משתמשת במדידות ספיגה צבעוניות לזיהוי פעילות אנזימטית ביעילות ובאופן אוטומטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ד&quot;ר סטיב Withers ו הונג מינג חן למתן DNP-Cellobioside המצע.

לפני שמתחילים בפרוטוקול זה, יהיה עליך בספרייה metagenomic שלך מאוחסנים בתבנית 384 צלחת היטב. במחקר שלנו, השתמשנו pCC1 לשלוט עותק וקטור fosmid בשילוב עם TransforMax phage T1 עמידים EPI300 T1-R א coli תאים כמארח הספרייה ומאוחסנים הצלחות שלנו ב -80 ° C 11. 1. שכפול של פלטות ספריית Metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירו צלחות המכיל את הספרייה ב 37 מעלות צלזיוס למשך כ 20 דקות, או עד בארות כל מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכונת אור UV לחיטוי על qPix2 כדי לעקר את הרובוט במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מרק LB עם chloramphenicol בריכוז הסופי של 12.5ug/mL ו arabinose ב 100ug/mL בבקבוק 500ml מגיב. כל צלחת ישתמשו 20mL כ, בתוספת לבצע 50 מ"ל נוספים כדי לאפשר נפח מת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת qFill3 כפי הוראות היצרן לכל עם בקבוק התקשורת מחוברת סעפת דרך צינורות הסטרילי. תוכנית זאת עבור הסכום המתאים של מדיה, ולהגדיר את זה כדי למלא נפח 45uL היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את האוויר ואת צינורות סעפת באמצעות התכונה לטהר של הרובוט עד המדיה גלוי בא להצמיד לכל אחד סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המספר הרצוי של צלחות עם התקשורת LB באמצעות qFill3. צלחת לכל אורך כ 20 שניות כדי למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צלחות ספריה צלחות טרי לאזורים המתאימים של הרובוט qPix2. מלאו את אמבטיות ניקוי עם ריאגנטים מתאימה; 2% Micro90 באמבטיה האחורי, autoclaved מים מזוקקים באמבטיה באמצע, 80% אתנול באמבטיה הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית "שכפול" של qPix2. בשנת תוכנה, בחר את הראש המתאים, מספר סוגים של פלטות מקור וצלחות היעד. גם הקים את הראש כדי לנקות בין משוכפלים, בדרך כלל 6 מחזורים באמבטיה כל זה מספיק. קיבולת של המכונה הוא 10 צלחות בכל פעם, וזה לוקח בערך 15 דקות כדי לשכפל את כולם עם ראש סיכה 384 (או כ -50 דקות עם ראש סיכה 96). הערה: אין אפשרות "לבחוש מקור" או "מערבבים יעד". מומלץ לא להשתמש באפשרויות אלה כבעיות התרחשו בעבר עם הרובוט שלנו להשתמש בהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות משוכפלים, לגדל את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתוך קופסת לחות. כי אנחנו גרימת מספר עותק גבוהה של fosmid עם תוספת של arabinose, שיבוטים נוטים לגדול לאט יותר מאשר אי - המושרה שיבוטים. החזר את הצלחות הספריה -80 ° C. הערה: דגירה בקופסת לחות מבטיח אידוי של התקשורת אינה מתרחשת בארות בשולי הצלחות, שמירה על סביבה אחידה עבור כל בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הרובוט qFill3 ידי הראשון טיהור אותו עם מים (~ 50 מ"ל) ולאחר מכן אתנול 80% (~ 50 מ"ל). לפרק את הרכיבים, ונקי החיטוי את הבקבוק, מכסה, צינורות עטופים בנייר אלומיניום. </li></ol> 2. מדידת צמיחה של E. coli המשובטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחות מ 37 ° C חממה. הסר להפריש את המכסים, וצלחות מקום על גבי פלטפורמת המגזין טוען המסופק עם RapidStak, עד מקסימום של 25 צלחות. הערה: צלחת בתחתית הערימה יהיה הראשון לקרוא. הקפד לעקוב אחר הסדר של הצלחות, כמו התוכנה אינה רשומה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחסנית אחת מן Stak המהירה, ודא הוא ריק, ו לדחוף אותו על ערימת צלחות לקרוא. תפוס אותו בידית, ולוחות צריכים להיות טעון לתוך המגזין. טען את המחסנית לתוך RapidStak. הערה: מגזין יש בורג קטן בפינה המציין אשר פינה את הבארות A1 של הצלחות צריך ללכת. המגזין רק הר של RapidStak בכיוון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית RE SkanIt במחשב המחובר למכונות. בחר "הפעלה חדשה" בשם כראוי. בחר "קורנינג קרקעית שטוחה-384 גם צלחת" כסוג צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור "פריסה פלייט", בחר את "אשף" כפתור, לבחור בו כדי להוסיף 384 נעלמים אל הצלחת שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור "פרוטוקול", בחרו באפשרות "ובכן Loop", והזן עבור 384 בארות. סמל "ובכן Loop" יופיעו עץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחר את הסמל ולחץ כדי להוסיף "מדידה photometric". הגדר אותו לקרוא 600nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור פרוטוקול שלך עם שם ייחודי, לסגור את התוכנית RE SkanIt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, פתח את התוכנית PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד הראשי תהיה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למכשיר RapidStak. VarioSkan צריך להיות בצד השמאלי של השולחן הזה. תחת הכותרת VarioSkan, יהיו שני קישורים: "RunSession" ו "לדגור". לחץ על האפשרות "RunSession". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש, החלון assay, יופיעו עם זרימה באמצע. בחר את "RunSession" פריט (זה צריך להיות הפריט הנוכחי בלבד). בצד ימין של המסך התפריט הנפתחיופיע. מצא את שמו של רי ששמרת SkanIt להפעיל בתפריט זה. הערה: נראה שיש לא מזמין רציונלי לתפריט הזה. זה לא אלפביתי, או לפי תאריך נוסף, או הקשורים בו במחשב פרוטוקול נשמר. זה אומר שאתה צריך להסתכל דרך כל הפרוטוקולים לפני מציאת שלך, וזה כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבחרת פרוטוקול שלך, בפינה הימנית העליונה לחץ על "הפעל assay". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת יצוץ, תתבקש לציין אשר מגזין להשתמש בו כמקור, ואשר מגזין ריקה. תיבת נמוך יותר על המסך המתאים מגזין הקדמי. [אופציונלי: הוא מבקש ממך להזין את מספר צלחות עמוסות לקבוע אומדן בסכום של זמן זה ייקח. אומדן זה הוא בדרך כלל רחוק.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו גם RapidStak ואת VarioSkan מופעלים, ולחץ על "אישור". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RapidStak יטען אוטומטית צלחות שלך לתוך קורא את הצלחת, המאפשר מדידה רציפה של הצלחות. כדי לקרוא את 25 צלחות לוקח כ 50 דקות. הערה: מומלץ לקיים את הטעינה הראשונה לתוך צלחת VarioSkan כדי להבטיח תיאום נאות של המכונות. אם RapidStak לא להעמיס על הקורא צלחת כראוי, להשתמש "זה assay השהה" כפתור בפינה הימנית העליונה של חלון PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VarioSkan נעשה לקרוא את כל הצלחות, להסיר את המגזין מלא ומניחים אותו על משטח הטעינה המגזין. הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה, ומגזין צריך להחליק משם, משאיר את הלוחות עומדים בערימה באמצע. החלף את המכסים על צלחות המתאים. </li></ol> 3. הוספת מערבבים את Assay על כל צלחת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת assay באמצעות מניות 10x premade של לערבב תמוגה (10% Triton X-100, RIS 100mm, 10mm EDTA) במאגר 50mm אצטט אשלגן ב-pH 5.5. הכינו מלאי של עד המצע DNP-cellobioside 75mg/mL ב DMSO, מוודא את המצע נמס לגמרי. הוסף DNP-cellobioside פתרון מניות לערבב assay לריכוז סופי של 0.1mg/mL. כל צלחת ישתמשו כ 20mL של פתרון, ובנוסף לעשות 50 מ"ל נוספים כדי לאפשר נפח מת. הערה: DNP-Cellobioside אינו מסיס בקלות במים, כך מתמוססת DMSO מגביר את מסיסות. הנוכחות של DMSO בפתרון הסופי assay אין תופעות נצפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת qFill3 כפי הוראות היצרן לכל עם בקבוק התקשורת מחוברת סעפת דרך צינורות הסטרילי. תוכנית זאת עבור הסכום המתאים של מדיה, ולהגדיר את זה כדי למלא נפח 45uL היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טהר את האוויר ואת צינורות סעפת באמצעות התכונה לטהר של הרובוט עד המדיה גלוי בא להצמיד לכל אחד סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לערבב assay אל כל צלחת באמצעות qFill3. צלחת לכל אורך כ 20 שניות כדי למלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לערבב assay הוא הוסיף, דגירה צלחות ב 37 ° C בקופסת לחות במשך 12-16 שעות. הערה: Over-הדגירה של צלחות פעם לערבב את assay נוסף יגרום אידוי של בארות החיצוני של הצלחת, מניב קריאות ספיגת גבוה יותר מאשר לראות את הבארות בפנים. זה יכול להיות מקוזז על ידי דוגרים צלחות בתא לחות. </li></ol> 4. ספיגת קריאה של המשובטים assayed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צלחות מ 37 ° C חממה. הסר להפריש את המכסים, וצלחות מקום על גבי פלטפורמת המגזין טוען המסופק עם RapidStak, עד מקסימום של 25 צלחות. הערה: צלחת בתחתית הערימה יהיה הראשון לקרוא. הקפד לעקוב אחר הסדר של הצלחות, כמו התוכנה אינה רשומה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחסנית אחת מן Stak המהירה, ודא הוא ריק, ו לדחוף אותו על ערימת צלחות לקרוא. תפוס אותו בידית, ולוחות צריכים להיות טעון לתוך המגזין. טען את המחסנית לתוך RapidStak. הערה: מגזין יש בורג קטן בפינה המציין אשר פינה את הבארות A1 של הצלחות צריך ללכת. המגזין רק הר של RapidStak בכיוון אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית RE SkanIt במחשב המחובר למכונות. בחר "הפעלה חדשה" בשם כראוי. בחר "קורנינג קרקעית שטוחה-384 גם צלחת" כסוג צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור "פריסה פלייט", בחר את "אשף" כפתור, לבחור בו כדי להוסיף 384 נעלמים אל הצלחת שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באזור "פרוטוקול", בחרו באפשרות "ובכן Loop", והזן עבור 384 בארות. סמל "ובכן Loop" יופיעו עץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחר את הסמל ולחץ כדי להוסיף "מדידה photometric". הגדר אותו לקרוא 400nm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור פרוטוקול שלך עם שם ייחודי, לסגור את התוכנית RE SkanIt. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, פתח את התוכנית PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעמוד הראשי תהיה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למכשיר RapidStak. VarioSkan צריך להיות בצד השמאלי של השולחן הזה. תחת הכותרת VarioSkan, יהיו שני קישורים: "RunSession" ו "Incubatדואר ". לחץ על" "אפשרות RunSession. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון חדש, החלון assay, יופיעו עם זרימה באמצע. בחר את "RunSession" פריט (זה צריך להיות הפריט הנוכחי בלבד). בצד ימין של המסך התפריט הנפתח תופיע. מצא את שמו של רי ששמרת SkanIt להפעיל בתפריט זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שבחרת פרוטוקול שלך, בפינה הימנית העליונה לחץ על "הפעל assay". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיבת יצוץ, תתבקש לציין אשר מגזין להשתמש בו כמקור, ואשר מגזין ריקה. תיבת נמוך יותר על המסך המתאים מגזין הקדמי. [אופציונלי: הוא מבקש ממך להזין את מספר צלחות עמוסות לקבוע אומדן בסכום של זמן זה ייקח. אומדן זה הוא בדרך כלל רחוק.] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאו גם RapidStak ואת VarioSkan מופעלים, ולחץ על "אישור" </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RapidStak יטען אוטומטית צלחות שלך לתוך קורא את הצלחת, המאפשר מדידה רציפה של הצלחות. הערה: מומלץ לקיים את הטעינה הראשונה לתוך צלחת VarioSkan כדי להבטיח תיאום נאות של המכונות. אם RapidStak לא להעמיס על הקורא צלחת כראוי, להשתמש "זה assay השהה" כפתור בפינה הימנית העליונה של חלון PolaraRS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר VarioSkan נעשה לקרוא את כל הצלחות, להסיר את המגזין מלא ומניחים אותו על משטח הטעינה המגזין. הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה, ומגזין צריך להחליק משם, משאיר את הלוחות עומדים בערימה באמצע. הצלחות יכול להיות מסולק על פי נהלי המעבדה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצא את ספיגת קריאות, לפתוח תוכנה SkanIt רי, ולבחור "פתח קובץ קיים". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הספרייה בה שמרת ההפעלה שלך, פגע "+" סמל כדי להרחיב את הרשימה תחת הכותרת הכותרת יהיו אפשרויות שכותרתו "מיכל 1" ל "מיכל N" בהתאם למספר צלחות. בחר את הצלחת הראשונה להיות מנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשורת התפריטים בחלקו העליון של הדף, בחר "עיבוד נתונים&gt; דווח / ייצוא" </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרויות הרצויות לייצוא. הערה: אני בדרך כלל לבחור "פריסה פלייט" ו "photometric" הנתונים לייצוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על "הצג דוח" ולאחר מכן "File&gt; Save". בחר את הספרייה הרצויה. תבנית הפלט הוא גיליון אלקטרוני של Microsoft Excel </li></ol> 5. נציג תוצאות דוגמה קריאות ספיגת מהצלחת 384 יחיד היטב המכיל שיבוט חיובי מוצג באיור 2. שיבוטים חיובית להראות עלייה ניכרת ספיגת פני אלה שלא להביע את פעילות cellulase. הבדלים זמן assay, מיקום טוב על הצלחת, או ריכוז DNP (ניתן הציג ידי סינון בלתי מומס DNP) יכולה להשפיע על ספיגת קריאות מוחלטת. קריאות ספיגת יחסית, כגון ההבדל ספיגת מעל הממוצע צלחת או ממוצע העמודה, הם שיטה חזקים יותר לזהות שיבוטים חיובי cellulase. בעקבות זיהוי של שיבוטים חיובי מהצלחות ספריה, מומלץ לשכפל כל שיבוטים חיובית לתוך צלחת חדשה לסינון משנית. זה מבטל תופעות הנובעות מיקום טוב או וריאציה צלחת ומאפשר השוואה ישירה בין שיבוטים יותר חיובי. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תרשים זרימה של assay תפוקה גבוהה עבור ספריית metagenomic משובטים לתוך E. coli ומאוחסנים ב -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ספיגת קריאות מתוך צלחת אחת 384-clone המכיל גם חיובית. שיבוטים חיובי cellulase ניתן לזהות על ידי ספיגת גדל באופן משמעותי על שיבוטים שלילית.

<ol><li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+of+cellulosic+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li>
<li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li>
<li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outlook+for+cellulase+improvement%3A+Screening+and+selection+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Advances%22%5BJournal%5D)">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+And+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+assay+methods%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem+and+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li>
<li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram%27s+Iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li>
<li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li>
<li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases%3A+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1%2C4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li>
<li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li>
<li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+amplifiable+BACs%3A+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li>
<li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li>
<li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מסך התפוקה גבוהה לגילוי המהיר של הפעילות cellulolytic מתוך ספרייה גדולה להכניס DNA הגנומי metagenomic לידי ביטוי E. coli מתואר בפרוטוקול זה. שיטה זו מהווה שיפור של assay האדום CMC / קונגו נפוץ בספרות. זהו פתרון המבוסס, ומאפשר הקרנה חד סיר הכימיה-384 גם צלחות, עם הפלט הסופי כמו קריאות ספיגת מקורא צלחת המאפשר ניתוח כמותי. האוטומציה של כל שלב של תהליך זה מאפשר הקרנת ללא השגחה של יותר מ -25 צלחות 384-היטב לשעה. הנתונים ניתן לייצא בקלות לתוך הגיליון האלקטרוני של Microsoft Exce...

<table><tbody><tr><td>qPix2</td><td>Genetix</td><td></td><td>עם ראש סריקה של 384 פינים</td></tr><tr><td>qFill3</td><td>Genetix</td><td></td><td>עם סעפת של 384 בארות</td></tr><tr><td>Varioskan</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapidStak</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>מחובר ל-Varioskan</td></tr><tr><td>חומר ניקוי Micro90</td><td>Cole-Parmer</td><td>18100-00</td><td>מדולל ל-2% במים</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Major Lab Supplier</td><td></td><td>מדולל ל-80% במים</td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>12.5mg/mL באתנול</td></tr><tr><td>מצע LB, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>25g/L, שעבר עיקור באוטוקלב</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטות בעלות תחתית שטוחה של 384 בארות</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>100mg/mL במים</td></tr><tr><td>אצטט פוטסיום</td><td>Fisher Scientific</td><td>P171</td><td>50mM במים, שעבר עיקור באוטוקלב, pH הותאם ל-5.5 באמצעות HCl</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>בתמיסת בופר TE, 100mM</td></tr><tr><td>מלח EDTA disodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>בתמיסת בופר TE, 10mM</td></tr><tr><td>2,4-dinitrophenyl cellobioside</td><td></td><td></td><td>סופק על ידי ד"ר Steve Withers, UBC</td></tr><tr><td>דימטיל סולפוקסיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr></tbody></table>

מסך התפוקה גבוהה עבור biomining פעילות cellulase מספריות metagenomic

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

תאית, המקור הנפוץ ביותר של פחמן אורגני על פני כדור הארץ, יש טווח רחב יישומים תעשייתיים עם דגש הולך וגובר על ייצור דלק ביולוגי 1. שיטות כימיות לשנות או לבזות תאית בדרך כלל דורשים חומצות חזקות וטמפרטורות גבוהות. ככזה, שיטות אנזימטיות הפכו בולטים בתהליך bioconversion. בעוד זיהוי cellulases פעיל מן מבודד חיידקים ופטריות הייתה יעילה למדי, הרוב המכריע של חיידקים בטבע להתנגד טיפוח מעבדה. הגנומי הסביבה, הידוע גם גישות, הקרנת metagenomic יש הבטחה גדולה לגשר על הפער טיפוח בחיפוש אחר אנזימים bioconversion רומן. גישות ההקרנה Metagenomic התאוששו בהצלחה cellulases רומן מסביבות מגוונות כגון 2 קרקעות, תאו כרס פנימית 3 ו טרמיטים האחוריות בטן 4 משתמש (CMC) carboxymethylcellulose צלחות אגר מוכתם קונגו צבע אדום (מבוסס על שיטת Teather ועץ 5). עם זאת, השיטה CMC היא מוגבלת התפוקה, אינו מתבטא כמותית אות נמוך יחס רעש 6. שיטות אחרות דווחו 7,8 אבל כל אחד להשתמש בצלחת אגר מבוססי assay, אשר אינה רצויה להקרנה תפוקה גבוהה של ספריות גנטי גדול להוסיף. כאן אנו מציגים פתרון המבוסס על המסך לפעילות cellulase באמצעות dinitrophenol chromogenic (DNP)-cellobioside המצע 9. הספרייה שלנו משובטים לתוך השליטה pCC1 את העותק fosmid כדי להגביר את הרגישות assay באמצעות אינדוקציה עותק מספר 10. השיטה משתמשת בסיר אחד הכימיה-384 גם microplates עם readout הסופי כאמור מדידת ספיגת. Readout זה כמותי, רגיש אוטומטית עם תפוקה של עד 384-100x צלחות טוב ליום באמצעות המטפל נוזלי קורא צלחת עם מערכת לערום המצורפת.

פרוטוקול זה מתאר מסך התפוקה גבוהה לפעילות cellulolytic מספריית metagenomic לידי ביטוי Escherichia coli. המסך הוא פתרון מבוסס מאוד אוטומטיות, ומשתמש אחד סיר כימיה 384 microplates היטב עם readout הסופי כמו מדידת ספיגת.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

תאית, המקור השכיח ביותר לפחמן אורגני על פני כדור הארץ, בעלת יישומים תעשייתיים רחבים עם דגש גובר על דלק ביולוגי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות שיבוטים המבטאים cellulase מספרייה מטגנומית. דבר זה מושג תחילה על ידי שכפול של ספרייה מטגנומית שהוכנה בעבר באמצעות רובוט, לאחר דגירה של הספרייה המשוכפלת בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. הצמיחה של שיבוטי ה-e coli נמדדת, ולאחר מכן מתווספים לספרייה המשוכפלת חומר לליזיס, באפר ותסריט (substrate).בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פעילות של cellulase באמצעות מדידות ספיגה קולורימטריות בעזרת קורא לוחות. שלום, אני קית' מהמעבדה של סטיבן הלאם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת הבריטיש קולומביה. היום נראה לכם פרוצדורה לסריקה תפקודית בהספק גבוה של ספריות מטגנומיות.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור פעילות cellulase ביומינית מספריות מטגנומיות. אם כן, נתחיל. לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו ספרייה מטגנומית המאוחסנת בפורמט של פלטת 384 בארות.במחקר זה נעשה שימוש בוקטור ה-SMID מסוג PCC one copy control בשילוב עם תאי e coli מסוג Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant כמארח לספרייה. כדי להתחיל את ההליך, הוציאו את הפלטות המכילות את הספרייה מטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והמיסו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות. במקביל, השתמשו במערכת עיקור באור UV של ה-QIX two כדי לעקר את הרובוט למשך 15 דקות. הגדירו את ה-Q fill three לפי הוראות היצרן, כאשר בקבוק המדיית מחובר לסבון (manifold) באמצעות הצינור הסטרילי המתוכנת.מלאו את ה-Q fill three בכמות המתאימה של מצע והגדירו אותו למילוי נפח של 45 µL. בכל באר, נקו את האוויר מהצינור והמניפולטור באמצעות תכונת הניקוז (purge) של הרובוט עד שניתן יהיה לראות את המצע. בכל פין של המניפולטור, מלאו את מספר הפלטות הרצוי במצע LB באמצעות ה-Q fill three.מילוי כל פלטה אורך כ-20 שניות. לאחר מכן, טענו את פלטות הספריה ואת הפלטות הרקנות לאזורים המתאימים של ה-Q picks. הפעילו את הרובוט למילוי אמבטיות הניקוי בריאגנטים המתאימים.2% micro 90 באמית השטיפה האחורית, מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב באמית השטיפה האמצעית, ו-80% ethanol באמית השטיפה הקדמית. באמצעות תוכנית השכפול של ה-qix two, בחרו את הראש המתאים וכן את המספר והסוגים של פלטות המקור והיעד. הגדירו בנוסף את הראש לבצע ניקוי בין השכפולים.בדרך כלל שישה מחזורים בכל אמבטיה הם מספיקים. קיבולת המכשיר היא 10 פלטות בו-זמנית. הגדירו את המכשיר להפעלה.תהליך השכפול ייקח כ-15 דקות. קיבולת מלאה עם ראש בעל 384 פינים. לאחר שכפול הפלטות, גדלו את הפלטות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות בתיבת לחות.זמן הדגירה הממושך נחוץ כיוון שמספר עותקים גבוה של smid מונחה באמצעות הוספת arabinose. בינתיים, נקו את הרובוט Q fill three כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הדגירה, הוציאו את הפלטות מהדגירה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.הניחו את המכסים בצד והניחו את הפלטות על פלטפורמת טעינת המחסנית המסופקת עם ה-rapid stack. הקפידו לעקוב אחר סדר הפלטות, מכיוון שהתוכנה אינה עושה זאת. הפלטות שבתחתית הערימה הן שיקראו.ראשית, הוצאו מגזין אחד מהערמה המהירה. ודאו שהוא ריק והניחו אותו על ערמת הפלטות המיועדת לקריאה. תפסו את המגזין בידית, והפלטה אמורה להיטען לתוך המגזין.הכנס את המגזין למערכת הערימה המהירה (rapid stack) בכיוון הנכון. פתח את תוכנית הסריקה במחשב המחובר. בחר ב-new session ותן לה שם מתאים.בחרו בלוחית 384 בארות בעלת תחתית שטוחה (flat bottom 384 Well plate) כלוחית. הקלידו באזור פריסת הלוחית. בחרו בכפתור ה-wizard והשתמשו בו כדי להוסיף 384 דגימות לא ידועות (unknowns) ללוחית.באזור הפרוטוקול, בחרו באפשרות well loop והזינו 384 wells. סמל של well loop יופיע בעץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחרו בסמל ולחצו כדי להוסיף photometric measurement.הגדירו אותו לקריאה ב-600 nanometers. שמרו את הפרוטוקול תחת שם ייחודי וסגרו את תוכנת הסריקה. לאחר מכן, פתחו את תוכנת polara RS.בעמוד הראשי מופיעה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למערכת ה-rapid stack; תחת הכותרת VARI scan, לחצו על אפשרות ה-run session. לאחר מכן אמור להופיע חלון הבדיקה עם תרשים זרימה במרכזו. בחרו בפריט run session, ולאחר מכן חפשו את שם הסריקה השמורה.יש להפעיל אותו מחדש בתפריט הנפתח המופיע בצד ימין של המסך. לאחר בחירת הפרוטוקול, לחץ על run. בשלב זה יופיע חלון שיבקש לציין באיזה מגזין להשתמש כמקור ואיזה מגזין ריק.התיבה התחתונה על המסך תואמת למגזין הקדמי. ודאו שגם ה-rapid stack וגם ה-Vario scan דלוקים, ולחצו על start. ה-rapid stack יטען באופן אוטומטי את הפלטות לתוך קורא הפלטות, מה שיאפשר מדידות רציפות של הפלטות.עקבו אחר טעינת הפלטה הראשונה לתוך ה-Vario scan כדי לוודא יישור נכון של המכשירים לקריאה. סריקת 25 פלטות אורכת כ-50 דקות. עם סיום סריקת ה-Barrios, הוציאו את המגזין המלא והניחו אותו על פלטפורמת טעינת המגזינים.הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה והמגזין אמור להחליק החוצה, כך שהפלטות יישארו עומדות בערימה במרכז. לבסוף, החזירו את המכסים על הפלטות עבור סריקה מבוססת תמיסה. עבור בדיקת פעילות צלולוז תחילה, הכינו את תערובת המבחן באמצעות תמיסת מנתק (lysis) ריכוזית פי 10 שהוכנה מראש.ערבב עם באפר פוטסיום אצטט 50 millimolar ב-pH 5.5 כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הכן תמיסת סטוק בריכוז של עד 75 milligrams per milliliter של סובסטרט כרומוגני DIPHENYL או DNP להשמדת תאים ב-DMSO, תוך וידוא שהסובסטרט מומס לחלוטין. הוסף תמיסת סטוק של DNP להשמדת תאים לתערובת הבדיקה עד לריכוז סופי של 0.1 milligrams per milliliter.יש לקחת בחשבון שכל פלטה דורשת כ-20 milliliters של תמיסה, ונדרשים 50 milliliters נוספים כדי לפצות על נפח מת, (dead volume). הגדירו את ה-Q fill three כפי שנעשה קודם לכן עבור תערובת הבדיקה לכל פלטה באמצעות ה-Q fill three. מילוי של כל פלטה אורך כ-20 שניות.לאחר הוספת תערובת הבדיקה, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 16 שעות. בתוך קופסת לחות, הוציאו את הפלטות מהמדגירה בטמפרטורה של 37 °C. הניחו את המכסים בצד והניחו את הפלטות על פלטפורמת טעינת המגזין המסופקת עם ה-rapid stack באותו אופן כפי שנעשה קודם לכן.פתחו את תוכנית הסריקה והגדירו אותה כפי שנעשה בעבר, למעט המדידה הפוטומטרית, שצריכה להיות מוגדרת לקריאה ב-400 nanometers. לאחר מכן, הזינו את הפרמטרים לתוכנת ה-POLARA RS, כפי שהודגם קודם לכן.אפשרו לסורק ה-Vario לקרוא את הפלטות. לאחר סיום ההרצה, הסירו את הפלטות והשליכו אותן. כדי לייצא את קריאות הבליעה, פתחו את התוכנה scan it re ובחרו.פתח קובץ קיים. בחר את הספריה שבה נשמר הסשן ולחץ על אייקון הפלוס כדי להרחיב את הרשימה. תחת כותרת הכותרת יופיעו אפשרויות המסומנות כ-container one עד container N. בהתאם למספר המגשים, בחר בתפריט העליון של הדף את המגש הראשון לניתוח, ובחר ב-data report export.בחרו אפשרויות לייצוא, כגון פריסת הפלטה ונתונים פוטומטריים. לחצו על "view report" (צפייה בדוח), ולאחר מכן על "file save" (שמירת קובץ). בחרו את הספריה הרצויה.פורמט הפלט הוא גיליון Microsoft Excel. כאן מוצגות קריאות של בליעה (absorbance) מלוח 384 בארות בודד המכיל שיבט חיובי; כפי שניתן לראות, שיבטים חיוביים מראים עלייה בולטת בבליעה בהשוואה לשיבטים שאינם מביעים פעילות של cellulase.הבדלים בזמן הבדיקה, בבאר, במיקום על הפלטה או בריכוז ה-DNP עשויים להשפיע על קריאות הבליעה המוחלטות. קריאות בליעה יחסיות, כגון ההפרש בבליעה מעל הממוצע של הפלטה או הממוצע של העמודה, הן שיטה מהימנה יותר לזיהוי שיבולים חיוביים לצלולאז. הרגע הראינו לכם כיצד לזהות שיבולים חיוביים לצלולאז מספרייה מטגנומית.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להמיס את ה-DNP cell bio side ב-DMSO ולהדגיר את הפלטות בתא לחות. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

אנו מתארים עלות נמוכה, גבוה שיטת התפוקה למסך לפעילות endoglucanase פטרייתי...

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.

תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic

מקור: קים, ה. ואח', סקר רב-אנזימטי באמצעות מערכת סקר אנזימים גנטית בעלת תפוקה גבוהה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שיטת סינון גנטית לזיהוי ביטוי אנזימים באמצעות ספריות פוסמידים מטאגנומיות וסובסטרטים כרוגניים. ציטומטריית זרימה מזהה ומבודדת תאים בודדים המייצרים תוצרים צבעוניים, ומאפשרת בחירה בתפוקה גבוהה של תאים פעילים המבטאים אנזימים.

זיהוי ביטוי אנזימי מטרה בתאים חיידקיים מהונדסים גנטית

צמחי טבק ששימשו להפקת cellulase פטרייתי, TrCel5A, באמצעות מערכת ביטוי חולפת. הביטוי יכול להיות במעקב באמצעות חלבון היתוך ניאון, ופעילות החלבון התאפיינה הודעה ביטוי.

ביטוי של רקומביננטי Cellulase Cel5A מ<em&gt; Reesei Trichoderma</em&gt; בצמחים טבק

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

CRISPR-Cas9 הטכנולוגיה מספקת שיטה יעילה בדיוק לערוך את הגנום היונקים בסוג תא כלשהו ומייצג את האמצעים הרומן לבצע מסכי גנטי רחב הגנום. פרוטוקול מפורט לדון בצעדים הנדרשים עבור ביצועים מוצלחים של מסכי CRISPR-Cas9 הגנום הרחב מסופק כאן.

מסכי גנטי מבוססי CRISPR במאגר תאים ממיונקים

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

למדו שיטת סקרון גבוהה-תפוקה לזיהוי קלונים מבטאי צלולאז מספריית מטגנומיקה ב-Escherichia coli. השיטה משתמשת במדידות ספיגה צבעוניות לזיהוי פעילות אנזימטית ביעילות ובאופן אוטומטי.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

גלה סרטונים נוספים