אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:36 דק׳ • August 31st, 2026
התחל עם תרחיף המכיל משקעים של אינטסומים של prototype foamy virus או PFV, אינטגראזות מונומריות, אוליגומרים של DNA ומצברי חלבונים.
אינטסומים של PFV הם טטראמרים של אינטגראזות ויראליות המקומפלקסות עם אוליגומרים סינתטיים המדמים DNA גנומי ויראלי.
הוסיפו תמיסת מלח לסספנסיה והדגירו על קרח. המלח מפחית את האינטראקציה האלקטרוסטטית בין האינטסומים, ובכך מאפשר למשקעים להתמס.
בצעו פיפוט עדין במרווחי זמן קבועים כדי לעודד את המסת האינטסום (intasome).
סבב במצנטריפוגה להשקעת המשקעים שנותרו ואסוף את העילאי המכיל אינטסומים ממיסים.
השתמש בעמודת כרומטוגרפיית סמך-הדרה (SEC) שעברה שיווי משקל מוקדם וממולאת בחרוזי אגרז קשורי-צלב, והעמס את supernatant על העמודה.
בשל גודלם הרב, אגרגטים של חלבונים ואינטסומים עוקפים את נקבי החרוזים ונשטפים מוקדם יותר.
אינטגראזים מונומריים ואוליגומרים קטנים יותר חודרים לנקבי החרוזיקים ונשטפים מאוחר יותר.
אספו את הפראקציות המוקדמות המכילות אינטזומים (intasomes) לצורך ניתוחים המשכיים.
הכינו שני קצות פיפט רחבים (wide-bore) על ידי הסרה של 2-4 מ"מ מקצה של טיפ של 20 µL באמצעות להב תער או סקלפל חדש על משטח נקי. הוציאו את צינור הדיאליזה מתוך תמיסת הדיאליזה. כדי למנוע דילול של דגימת האינטסום (intasome) על ידי תמיסת דיאליזה שעלולה להישאר בקצה הצינור ליד התפסן, השתמשו במיקרופיפט עם טיפ קטן כדי להסיר כל שארית של תמיסת דיאליזה.
הסיר את התליב מקצה זה של צינור הדיאליזה. בעת השבת המבנה, חשוב לאסוף כמה שיותר מהתמיסה ומהמשקע. השתמש בטיפ פיפט בעל פיה רחבה כדי להעביר את הדגימה, כולל המשקע, מתוך צינור הדיאליזה אל מבחנה בנפח 1.5 מיליטר על קרח.
יש לשים לב לנפח הכולל של החומר שהוחזר. הנפח הכולל הוא בדרך כלל כ-140 µL. הדגימה עם המשקע נמצאת בריכוז של 20 mM NaCl.
העלה את ריכוז המלח לריכוז סופי של 320 millimolar sodium chloride על ידי הוספת הנפח המתאים של תמיסת stock five molar sodium chloride. העבר את דלי הקרח עם הדגימה לחדר קירור של ארבעה מעלות צלזיוס. השתמש בקצה פיפטה רחב (wide-bore pipette tip) כדי להחזיר את המשקע לסuspended ולמסלסל אותו באמצעות פיפטינג.
חזור על הפעולה כל 20 דקות למשך שעה אחת לפחות. רוב המשקע אמור להיכנס לתמיסה. כדי לטהר את האינטזום, השגה שיווי משקל בעמודת כרומטוגרפיית הדירה של ג'ל אגרוז קשיר (SEC) באמצעות בופר הרצה של SEC בקצב זרימה של 0.4 מיליטר לדקה.
סנטריפוג את דגימת האינטסום (intasome) במיקרו-סנטריפוגה ב-14,00 ×g למשך 10 דקות ב-4 ˚C כדי לשקע משקעים שנותרו. לאחר הסרה זהירה של הנוזל העליון (supernatant), העבר אותו ללולאת הזרקה (injection loop) של 20 µL. החדר את הדגימה לעמודת ה-SEC.
בצעו אלוטציה עם 25 milliliters של בופר הרצה ל-SEC ואספו 95 פראקציות של 270 microliters. שימו לב שהכרומטוגרם של ה-SEC מציג שלושה שיאים של A280 ו-A260.