אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:23 דק׳ • August 31st, 2026
התחל עם תמיסת סטנדרט של RNA ויראלי סינתטי, המדוללת בסדרה בתוך מצע תרבית.
דילולים אלו משמשים כתקני ייחוס לכימות ה-RNA הנגיפי בדגימות.
כעת, קחו את העל-נוזל (supernatant) המכיל את הווירוס מתרבית התאים המודבקת בווירוס.
תווך גידול זה מכיל מעכב הנקשר לאנזימים מפרקי RNA ומונע את פירוק ה-RNA הוויראלי.
הוסף את בופר העיבוד המכיל את אנזים ה-proteinase K.
סובב את התמיסה בצנטריפוגה לזמן קצר כדי להבטיח ערבוב אחיד.
הנח את פלטת ה-PCR המכילה את הדגימות בתוך התרמוסייקלר.
ראשית, דגרו בטמפרטורה מתונה כדי להפעיל את ה-proteinase K.
אנזים זה מעכל את החלבונים הנגיפיים העוטפים את הגנום, ובכך משחרר RNA נגיפי אל תוך התמיסה.
לאחר מכן, דגרו בטמפרטורה גבוהה יותר כדי לנטרף את האנזים ולדנטור את ה-RNA.
לבסוף, אחסנו את הדגימות המעובדות בתנאי קירור עד לביצוע ניתוח RT-qPCR.
ראשית, ערבבו 199 microliters של תמיסת עיבוד (processing buffer) עם microliter אחד של proteinase K נקי מנוקלאזים (nuclease free). באמצעות מצע תרבית תאים, בצעו דילול סדרתי של ה-RNA של ה-three prime UTR של נגיף הדנגה (Dengue virus) שהוכן ביחס של אחת לעשרה, כדי לקבל סטנדרטים של RNA בריכוזים הנעים בין 5,000,000 ל-5,000 עותקים ל-microliter, באמצעות פיפוט חוזר וערבול במערבל Vortex. העבירו 5 microliters של עליון התרבית (culture supernatant) של תאים שנדבקו בנגיף הדנג
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים