אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:52 דק׳ • August 31st, 2026
התחל עם תרבית של תאי סרטן כבד אנושיים שעברו טרנספקציה של RNA של נגיף הדלקת כבד E (HEV) כדי לייצר חלקי נגיף.
חלק מה-HEVs רוכשים ממבנה של ממברנה אנדוזומלית מהמארח ויוצאים מהתא, בעוד שאחרים נשארים בתוך התא כ-HEVs לא מעטופים.
כדי לאסוף חלקי HEV חוץ-תאיים, אספו וסננו את עליון התרבית כדי להסיר פסדתיים תאיים.
יש לאחסן בטמפרטורה נמוכה במיוחד כדי לשמר את היכולת להדבקה.
כדי לאסוף חלקיקי HEV תוך-תאיים, שטפו את התאים עם בופר.
הוסיפו trypsin-EDTA כדי לנתק את התאים, ולאחר מכן הוסיפו מצע גידול כדי לעצור את הפעילות האנזימטית.
העבירו את התרחיף למבחנה וסובבו בצנטריפוגה.
שפכו את העלייה המכילה שאריות trypsin. תלו את המשקע והעבירו אותו למבחנה.
הקפיאו את התאים בחנקן נוזלי והפשירו אותם על קרח.
חזור על מחזורי ההקפאה וההפשרה כדי ל lysed את התאים ולשחרר את הווירוסים.
סנטריפוגה, אסוף את העל-נוזל המכיל את הווירוסים, ואחסן בטמפרטורה נמוכה מאוד.
ביום השישי, סננו את העלייה (supernatant) דרך רשת של 0.45 micrometer כדי להסיר שאריות תאים, ואחסנו את נגיף ההפטיס E שנוגזר מתרבית תאים חוץ-תאיית בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. לקציר חלקיקי נגיף ההפטיס E שנוגזרו מתרבית תאים תוך-תאיית, שטפו את התאים עם PBS ונתקו את התאים באמצעות 1.5 milliliters של 0.05% trypsin-EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות Celsius. לאחר שהתאים נתקו, עצרו את התגובה עם 8.5 milliliters של DMEM והעבירו את תרחיף התאים לפרוקת של 50 milliliters לצורך סנטריפוגציה.
הוסיפו 1.6 milliliters של מצע DMEM מלא לכל אלקטרופורציה אל מבחנות תגובה אינדיבידואליות בנפח של שני מיליטר, והשתמשו ב-800 microliters מהמצע כדי לסבסב את התאים, ובכך העבירו את התאים למבחנות. הקפיאו את התאים בחנקן נוזלי, ולאחר מכן הפשירו את התאים על קרח שלוש פעמים לפני צנטריפוגציה במהירות גבוהה של הליזאטים שהתקבלו למשך 10 דקות ב-10,0 times g. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנאנטים למבחנות חדשות מבלי להפריע למשקעי פסולת התאים, לצורך אחסון בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius.