טיהור נגיף מנוזל האלנטואיס של ביצי תרנגולת עם עוברים

התחילו עם מאגר המכיל נוזל אלנטואיס (allantoic fluid) שהופק מביצי תרנגולת נגועות בנגיף.

נוזל זה מכיל חלקי וירוס יחד עם מזהמים שמקורם במארח.

העבירו את הנוזל דרך מסנן עומק כדי ללכוד מזהמים גדולים, תוך כדי מתן אפשרות למזהמים קטנים יותר ול প্রচুর וירוסים לעבור.

לאחר מכן, העמיסו את הנוזל המסונן למערכת סינון, שבה הוא זורם באופן משיקי על פני שטח הממברנה.

מזהמים קטנים יותר עוברים דרך הממברנה, בעוד שהנגיף נשאר ומתרכז.

טען את הווירוס המרוכז על גבי מדרג צפיפות ובצע סבוב בצנטריפוגה. הווירוס ייצור פס ברור בנקודה שבה צפיפותו תואמת לצפיפות המדרג.

אספו את הפס העשיר בנגיף לתוך קסטת דיאליזה והניחו אותה בתוך בופר. רכיבי הגרדיאנט יפעפפו החוצה, בעוד שמים מהבופר יפעפפו פנימה דרך הממברנה החדירה למחצה.

בשלב הבא, הניחו את הקסטרה בתוך תמיסה היפרטונית כדי לשאוב החוצה מים ולרכז את הנגיף המטוהר.

לצורך טהרתו של נגיף מחלת ניוקאסל (Newcastle Disease Virus או NDV), ראשית, הכינו את המערכת הניסויית שהוגדרה מראש על ידי העברת 50 milliliters של PBS דרכה.

עצרו את המשאבה כאשר נותרו בערך חמישה מיליליטרים של PBS בתוך המבחנה. לאחר מכן, חברו למערכת צינורות מסנן עומק (depth filter) עם דירוג רטנציה של מיקרומולר אחד עד שלושה. כדי לאוורר את המסנן, הסירו את הפקק השני בצד העליון של מסנן העומק, ואז התחילו להעביר 50 מיליטרים נוספים של PBS דרך המערכת.

ברגע ש-PBS מתחיל לזרום דרך הפתח בחלקו העליון של המסנן, סגרו את הפתח והמשיכו להזרים PBS דרך הצינורות. לאחר מכן, החליפו את כלי הפסולת בכלי איסוף סטרילי חדש והתחילו להעביר נוזל אלנטואיס דרך מסנן העומק. לאחר מכן, הגדירו את מערכת הסינון בסריקה ממושכת (tangential flow filtration או TFF) בתצורה פתוחה והפעילו אותה כפי שמתואר במאמר.

כאשר נותרים כ-5 מיליטרים של נוזל במכל, עצרו את המשאבה והוסיפו לנוזל allantoic שעבר סינון עומק (depth filtration) אל המכל. לאחר מכן, הפעילו שוב את זרימת המשאבה. כדי למנוע גזירה (shearing) של הנגיף, חשוב לוודא שלחץ המערכת אינו עולה על 10 pound force per square inch.

כדי להגביר את האלוציה, יש להשתמש בשילוב של מהירות משאבת הפריסטלטיקה ותפסנית C-clamp. כאשר נשארים 10 עד 150 מיליטר של נוזל אלנטואיס במאגר, יש להשהות את המשאבה ולהחליף את התמיסר על ידי הוספה של 150 עד 20 מיליטר של ML buffer. שוב, יש להשהות את המשאבה כאשר נשארים 5 עד 10 מיליטר של נוזל במאגר, ולאחר מכן לסגור את קווי הפסולת באמצעות שתי תפסניות C-clamps.

נתקו את קו הרטנטט (retentate) המוזין את המכל והכניסו אותו למבחנה קונית של 50 מיליטר. לאחר מכן, חזרו לזרימה ועצרו כאשר נותרו טיפות בודדות של נוזל במכל המאגר. לאחר מכן, הסירו את ת clamps-C מקווי הפסולת וחברו מחדש את קו הזנת הרטנטט למכל המאגר.

בינתיים, כדי להכין את העיקר לאולטרסנטריפוגציה במדרג צפיפות של iodixanol, הוסיפו תחילה 0.5 milliliters של iodixanol בריכוז 40% למבחנה של אולטרסנטריפוגה בעלת דופן דקה וראש פתוח בנפח 13.2 milliliter. לאחר מכן, הכינו את העמודה באמצעות הוספות עוקבות של 2.5 milliliters של iodixanol בריכוז 20%, ו-2.5 milliliters של iodixanol בריכוז 10%. לפני האולטרסנטריפוגציה, הוסיפו בזהירות שישה עד 6.5 milliliters של תמיסת הנגיף שהתהלכה ממערכת ה-TFF לעמודת ה-iodixanol, מבלי להפר את המדרג.

לאחר העלטרה-צנטריפוגציה, הוצא את המבחנות באמצעות פינצטה סטרילית. פס ה mục target צריך להיות פס רחב בין הגרדיאנטים של 10% ו-20%. לאחר מכן, תלה את המבחנה מעל כלי כימי (beaker) באמצעות מעמד מעבדה.

לאחר מכן, חברו מחט בגודל 1.5 אינץ׳ ובכידון 18 למזרק של חמישה מיליטר, דקרו בעזרת המחט את דופן מבחנת האולטרסנטריפוגה והוציאו את הפס המטרה על ידי דחיפה איטית של הבוכנה. לאחר הסרת ה-iodixanol מתמיסת הנגיף כפי שמתואר במאמר, השתמשו במזרק כדי להזריק בזהירות את הנגיף לתוך קסטת דיאליזה. כדי לרכז את תמיסת הנגיף, הוציאו את קסטת הדיאליזה מתוך תמיסוף הדיאליזה והניחו אותה בתוך שקית פלסטיק קטנה הניתנת לאטימה.

לאחר מכן, הוסיפו לשקית 15 עד 25 מיליטר של polyethylene glycol בריכוז 40%, כך שקסטרת הדיאליזה תהיה שקועה לחלוטין.