תכנות מחדש של תאי דם אנושיים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים באמצעות נגיף סנדאי

קח תרבית של תאים חד גרעיניים של דם היקפי אנושי (PBMCs).

הוסיפו נגיף Sendai המקודד לגורמי שעתוק של תכנות מחדש. כסו ואטמו את הפלטה.

בצע סבוב במצנטריפוגה כדי להגביר את המגע בין הווירוס לתאים, ולאחר מכן דגור.

בעקבות היתוך הווירוס, ה-RNA הויראלי מבטא גורמי שעתוק המפעילים גנים של פלוריפוטנציה תאית ומדכאים גנים ספציפיים לשושלת כדי להתחיל את התכנון מחדש (reprogramming).

במהלך שלב זה, תת-אוכלוסייה של PBMCs שעברו טרנסדוקציה הופכת לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) ומבטאת חלבוני היצמדות.

העבירו אותם לבאר מצופה במטריקס והסביבו את התאים לצמידה. החליפו את העלוי במצע גידול.

לאחר הדגירה, תאי iPSCs נצמדים למטריצה, בעוד ש-PBMCs שאינם נצמדים שעברו טרנסדוקציה נותרים תלויים.

העבירו את הסספנזיה לבאר מצופה וסבבו בצנטריפוגה. הוסיפו את המצע לבאר המקורית והדגרירו את שתיהן.

שאר תאי ה-PBMCs שעברו טרנסדוקציה מתחילים בתהליך התכנות מחדש, הופכים ל-iPSCs ונצמדים. שלב זה ממקסם את שימור התאים שעברו תכנות מחדש.

החליפו את המצע מדי יום כדי לתמוך בצמיחת ה-iPSC.

בפרוצדורה זו, העבירו את תאי הדם למבחנה קונית של 15 מיליליטר, וספרו אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, הכינו 3 x 10⁵ תאים לטרנסדוקציה, וסובבו את התאים בצנטריפוגה ב-515 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השליכו את העליון באמצעות שאיבה, והשביו את התאים ב-0.5 milliliters של מצע תאי דם. לאחר מכן, העבירו את התאים לבאר של פלטת 24 בארות לא מצופה. הפשיתו את תערובת נגיף Sendai על קרח, והוסיפו אותה לתאים התלויים.

אטמו את הפלטה באמצעות סרט איטום, וסובבו אותה בצנטריפוגה במהירות של 1,150 ×g למשך 30 דקות ב-30 °C. לאחר הצנטריפוגציה, דגרו את התאים ב-37 °C ב-5% CO2 למשך לילה. כדי לצפות פלטה של 24 בארות ב-vitronectin, ביום למחרת, דללו את תמיסת ה-vitronectin ב-PBS כדי להגיע לריכוז סופי של 5 µg/ml.

בשלב הבא, הוסיפו מיליליטר אחד של vitronectin לבאר, והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, הסירו את תמיסת הציפוי והעבירו את כל המצע המכיל את התאים ואת הנגיף לבאר המצופה. לאחר מכן, אספו את התאים הנותרים באמצעות 0.5 מיליליטר נוספים של מצע תאי דם טרי והוסיפו אותם לבאר המכילה את התאים.

לאחר מכן, סובב את הפלטה בצנטריפוגה במהירות של 1,150 ×g למשך עשר דקות בטמפרטורה של 35 °C, ולאחר מכן, דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C ב-5% CO2 למשך הלילה. עבור העברה שנייה של התאים, כסה את הבאר ב-5 µg/ml vitronectin כפי שתואר קודם לכן. השתמש בבאר אחת בפלטה עבור כל טרנסדוקציה, והעבר את תרחיף התאים מהפלטה הראשונה לפלטת ה-vitronectin המצופה מחדש.

בינתיים, הוסיפו 1 ml של מדיום iPSC לבאר בלוח הראשון לצורך תחזוקה, והדגרירו אותו בטמפרטורה של 37 °C ב-5% CO2, תוך ביצוע החלפה יומית של המדיום למדיום iPSC טרי. מושבות יופיעו ביום ה-14 עד 21 לאחר הטרנסדוקציה. סבבו במערך צנטריפוגה את הלוח המצופה החדש, המכיל את התאים התלויים, ב-1,150 ×g בטמפרטורה של 35 °C למשך 10 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2 למשך הלילה. למחרת, הסירו את העלייה (supernatant) והחליפו אותה במצע טרי לתרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSC). תחזקו את התאים ההודבקים באמצעות החלפה יומית של המצע, עד להגעה ל-80% התמזגות (confluency).