ניתוח הפנמה של נגיף השפעת באמצעות בדיקת חסימת סטראפטאווידין

התחילו עם מבחנות המכילות תאי אפיתל של ריאה אנושית.

הוסיפו נגיפי שפעת biotinylated והדגירו על קרח. הנגיפים נקשרים לפני השטח של התא ללא התמססות פנימה (internalization).

סבב במצנטרליפוגה כדי להפריד את התאים הקשורים לנגיף, הסר את העלייה (supernatant) ובצע השהיה מחדש (resuspend).

למבחנה של נקודת הזמן הראשונה, הוסף streptavidin לא מסומן, הנקשר לנגיפים הביוטיניליים ויוצר קומפלקסים.

הוסיפו סטראפטאבידין המסומן בפורופור, אשר אינו נקשר לקומפלקס הסטראפטאבידין-ביוטין של הנגיף. שטפו וקבעו את התאים.

דגרו את המבחנה של נקודת הזמן המאוחרת יותר בטמפרטורה גבוהה יותר, כדי לאפשר את הפנימה של הווירוס (internalization), ולאחר מכן החזירו לקרח.

הוסיפו streptavidin לא מסומן וחומר חוסם התפשטות פנימה (internalization-blocking agent), המונע ספיגה נגיפית נוספת, והדגירו. Streptavidin נקשר לנגיפים ביוטיניליים הקשוריים לפני השטח, ולאחר מכן שטפו.

קבע את התאים והוסף באפר המכיל דטרגנט כדי להחדיר אליו חומרים (permeabilize).

שטפו והוסיפו streptavidin המסומן בفلורופור, אשר חודר לתאים נקשר לביוטין.

נתחו את הדגימות באמצעות ציטומטריה של זרימה.

פלואורסצנציה גבוהה יותר בנקודת הזמן המאוחרת יותר מאשרת הפנמה נגיפית מוצלחת.

לאחר חזרה על השטיפה פעם נוספת, קררו את המבחנות על קרח למשך 10 דקות. לאחר שהמבחנות התקררו, צנטריפגו שוב והשתמשו ב-100 microliters של נגיף biotinylated המדולל ב-infection PBS כדי לתוחח מחדש את המשקעים לאחר דגירה על קרח למשך שעה אחת; חזרו על הצנטריפוגה ושטפו עם PBS פעמיים, תוך עיבוד הדגימות הבאות במקביל ככל האפשר עבור דגימות דקה אפס.

כדי לטפל בדגימות של דקה אפס פלוס STV, סובבו את המבחנות, הסירו את העלייה והשתמשו ב-15 µL של STV ב-2% BSA ו-0.1% sodium azide ב-PBS כדי להחזיר למצב של סספנסיה את משקע התאים. דגרו על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן צנטריפוגו והשתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים לאחר קיבוע ב-PFA כפי שהודגם זה עתה, ואחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C.

עבור הדגימות של 30 דקות פלוס STV. לאחר סבסוב (pelleting), השביו מחדש את הדגימות ב-200 microliters של PBS 2% BSA, לאחר אינקובציה ב-37 degrees Celsius למשך 30 דקות.

סובב את התאים בצנטריפוגה ותלה אותם מחדש ב-50 µL של STV 2% BSA 0.1% Sodium azide ב-PBS, והדגרה על קרח למשך 30 דקות לפני השטיפה והקיבוע. לאחר מכן, לאחר ביצוע פרמיאביליזציה וצביעה של כל הדגימות ב-STV-Cy3, בהתאם לפירוט בפרוטוקול הכתוב, אחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C. לבסוף, נתח את הדגימות באמצעות ציטומטריית זרימה.