הערכת עיכוב גדילה בקטריאלית בתיווך פאגים באמצעות מדידות צפיפות אופטית

התחילו עם פלטת בארות (multiwell plate) המכילה תרחיף פאגים בדילול סדרתי בתוך ציר עשיר בחומרי הזנה כטיפול, וציר ללא פאגים כביקורת.

הוסיפו E. coli לכל באר. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את הצפיפות האופטית (OD) הבסיסית כדי לתעד את ריכוז החיידקים הראשוני.

לאחר מכן, דגרו את הפלטה כדי לאפשר צמיחה של החיידקים והדבקה של הפאגים.

בביקורת, החיידקים מנצלים חומרי הזנה ומתרבים, דבר המוביל לעלייה ב-OD.

במהלך הטיפול, פאגים נקשרים לקולטני פני השטח של החיידק ומזריקים את הגנום שלהם לתוך הציטופלזמה.

באמצעות מנגנוני התא המארח, הגנום הוויראלי משתכפל ומייצר חלבונים ויראליים, אשר מתחברים לחלקיקי וירוס חדשים. חלקיקים אלו גורמים לליזה של התא ומשחררים צאצאים.

מדדו את ה-OD במרווחי זמן כדי להשוות את הצמיחה הבקטריאלית.

בבארות הביקורת נראה עלייה הדרגתית ב-OD, בעוד שבבארות שטופלו בפאגים נצפו ערכי OD נמוכים יותר, עם הפחתות משמעותיות יותר בריכוזי פאג גבוהים יותר.

דבר זה מסייע בקביעת ריכוז הפאג הנדרש לעכבה מרבית של הצמיחה הבקטריאלית.

בתחילה, הגדירו את בדיקת המיקרו-פלטה תוך שימוש בטיפים מסוננים כדי למנוע זיהום צולב. ראשית, הוסיפו 180 microliters של mTSB לבארות בעמודות 1 עד 12 של מיקרו-פלטה בעלת 96 בארות. לאחר מכן, הכינו מהלולי דילול עשריים (tenfold) של כל פאג בעמודות 1 עד 8 של מיקרו-פלטות סטריליות בעלות 96 בארות להקמת הבדיקה. הוסיפו 20 microliters של פאגים בודדים או תערובות פאגים (phage cocktails) לבארות 1 עד 8 בשורה העליונה A של המיקרו-פלטה.

עבור ביקורת ללא פאג'ים וביקורת ריקה, הוסף 20 µL של mTSB לבאר העליונה בעמודות 9 עד 12. במהלך הפעולה, ערבב את תכולת הבאר באמצעות שאיבה עדינה וחוזרת לפחות חמש פעמים, והחלף טיפים בין הדילולות. הוצא 20 µL מהשורה האחרונה H, ולאחר מכן הכן מאגר עבור זן החיידקים הנבדק על ידי העברה של 2-3 mL של התרבית המדוללת אל המאגר באמצעות פפיטה של 1 mL.

בעזרת פיפט רב-ערוצי, העבירו 20 µL מהתרבית הבקטריאלית המדללת לכל באער בעמודות 1 עד 10, תוך החלפת טיפים בין הוספה להוספה. כסו והדגירו את המיקרופלטה בטמפרטורה של 37 °C. במרווחי זמן של שעתיים, הוציאו את המיקרופלטה מהאינקובטור וקראו את הפלטה באמצעות קורא מיקרופלטות.

לחלופין, הדגרו את הפלטה בתוך קורא מיקרופלטות וקראו את התוצאות לאורך זמן.