אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:48 דק׳ • August 31st, 2026
קח תרבית תאי יונקים בשלב סטציונרי עם רבב של רפליקציית DNA ואסוף את המדיום המותנה.
הוסיפו נגיף ההרפס סימפלקס (HSV) והדגירו עם ניעור מדי פעם כדי לאפשר היצמדות נגיפית. שטפו להסרת הנגיף שאינו קשור והחזירו את מצע הגידול המותאם.
לאחר הדגירה, הנגיף מתמזג עם ממברנת המארח ומשחרר את הנוקלאוקפסייד אל הציטופלזמה.
ה-dsDNA הנגיפי חודר לגרעין, עובר סיבוב (circularizes) ומבטא חלבונים נגיפיים לצורך רפליקציית ה-DNA הנגיפי.
החלבונים הוויראליים וחלבוני המארח פותחים את ה-DNA הוויראלי ומסנתזים פריימר RNA. לאחר מכן, קומפלקס ה-DNA polymerase הוויראלי נקשר ומאריך את הפריימר לצורך סינתזת DNA.
בעוד השכפול נמשך, הוסף אנלוג של נוקלאוזיד לתרבית. הוא חודר לתאים והופך לצורה של טריפוספט.
מכיוון ששכפול ה-DNA של המארח הוא מינימלי, האנלוג נטמע באופן מועדף ב-DNA ויראלי משתכפל, ובכך מסמן את הגנומים הוויראליים.
הגנומים הוויראליים המסומנים מוכנים לניתוח פרוטאומי של החלבונים הקשורים בהם.
התחל את הפרוצדורה בגידול תאי MRC-5 כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, דלל HSV-1 בממס Tris-Buffered Saline קר או TBS. עבור השלבים הבאים, חשוב לכבות את המפוח ואת מנדף תרביות הרקמה כדי למנוע התייבשות של התאים.
השתמשו בפיפטה כדי להעביר את מצע הגידול מתאי ה-MRC-5 לבקבוק סטרילי, על מנת להחזירו לתאים לאחר ההדבקה. הדביקו את התאים על ידי הוספת שבעה מיליליטרים של נגיף מדולל לתאים. נדנדו את התאים בכל 10 דקות למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר הספיחה (adsorption), שאבו את האינוקולום, שטפו את התאים עם 50 milliliters של TBS בטמפרטורת החדר והחזירו את מצע הגידול המקורי. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בנוכחות 5% carbon dioxide. לאחר תחילת השכפול של ה-DNA הוויראלי, כארבע שעות לאחר ההדבקה, סמנו את ה-DNA הוויראלי המשכפל.
כדי לעשות זאת, דללו EdC ב-1 mL של מצע גידול והוסיפו אותו למצע תרבית התאים של התאים המודבקים למשך שעתיים עד ארבע שעות.