בידוד חלבונים מקומפלקסים של DNA ויראלי-חלבון

קח את גרעיני התאים המכילים גנומים ויראליים, המסומנים עם נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין.

השעו את הגרעינים בתערובת של biotin-azide ויוני נחושת, והדגירו.

יון הנחושת מסייע בקשירה הקוולנטית של קבוצת האזיד והאלקין.

סנטריפוג את התמיסה והסר את הנוזל העליון (supernatant).

השעה מחדש בבופר, העבר וסב בצנטריפוגה להשקה.

הקפיאו במהירות (Flash-freeze), ולאחר מכן הפשיתו את המשקע כדי לסייע בליסיס.

שחזרו את הסספנסיה ובצעו סוניקציה כדי ללוס את הגרעינים.

סבבו בצנטריפוגה ואספו את העלייה המכילה קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי.

סננו את העילאי כדי להסיר מזהמים.

דללו את התסנין.

הוסיפו חרוזי מגנט מצופים בסטפטאבידין והדגירו כדי להקל על הקשירה למתחמי חלבון-DNA ביוטיניליים.

הפעיל שדה מגנטי כדי לאסוף את החרוזים, ושטוף כדי להסיר מזהמים.

חזור על השטיפה.

הוסיפו בופר אלוציה וחממו כדי להפריד ולהשכיב (denature) את החלבונים.

הפרידו את החרוזיים ואספו את התוצרי השטיפה (eluate).

הקפיאו במהירות (Flash-freeze) את החלבונים שבודדו. אחסנו בטמפרטורות נמוכות מאוד לצורך ניתוחים המשך.

לאחר הסרה מלאה של ה-PBS, השעה מחדש את משקע הגרעינים ב-10 milliliters של תערובת לתגובת קליק, על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה חמש פעמים באמצעות פיפט של 10 milliliters. סובב את הדגימה במשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבעה degree celsius, לפני השקיעה של הגרעינים כפי שבוצע קודם לכן.

הסיר לחלוטין את תערובת תגובת ה-click, לאחר מכן, שטוף את המשקע על ידי ריסוף עדין שלו ב-10 milliliters של PBS וסב נוסף במערך צנטריפוגלי. כעת, רסוף בזהירות את המשקע הגרעיני ב-one milliliter של PBS והעבר את התמיסה למבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של 1.5 milliliters. לאחר הצנטריפוגה, הסר לחלוטין את ה-PBS והקפא את המשקע בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי.

בנקודת זו, ניתן לאחסן את המשקע ב-80 degree celsius או להמשיך בביצוע הפרוצדורה. כדי ל puissent ללוות את הגרעינים ולפרק את ה-DNA, השהו שנית את הגרעינים שהופשרו ב-50 microliters של Buffer B1 באמצעות פיפוט מעלה ומטה. דגרו את התמיה על קרח למשך 45 דקות.

לאחר מכן, בצעו סוניקציה לדגימות שש פעמים למשך 30 שניות בכל פעם בעוצמה של 40% amplitude, באמצעות מיקרוטיפ עם חוד של שלושה מילימטרים. הניחו את הדגימות על קרח למשך 30 שניות לפחות בין הפולסים. לאחר הסוניקציה, הדגימות צריכות להיראות צלולות ולא עכורות.

שקיעו את ששאירי התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 14,0 x G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. גודל המשקע אמור להקטן באופן משמעותי; סננו את הנוזל העליון דרך מסנן תאים של 100 מיקרון ושמרו את הנוזל שעבר סינון. לאחר מכן, הוסיפו 50 microliters של Buffer B2 לנוזל העליון המסונן.

כדי לקשור את ה-DNA הביוטינילי לخرזיים מצופים בסטראפטאבידין, הכינו את חרוזי הסטראפטאבידין המגנטיים על ידי העברת 30 microliters של תגלי חרוזים למבחנה של microcentrifuge בנפח 1.5 milliliter. הכינו מבחנה אחת של חרוזים עבור כל דגימה. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם milliliter של Buffer B2 על ידי ערבוב ב-vortex להשהיה מחדש, הצמדה למגנט כדי להפריד את החרוזים ושאיבה של בופר השטיפה.

לאחר מכן, הוסף 90 microliters מהדגימה לחרוזים השטופים. שאר הדגימה תשמש לבידוד DNA וחלבון של ה-input. סובב את התמיה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס (°C).

למחרת, הניחו את הדגימות במעמד מגנטי למבחנות מיקרוצנטריפוגה והסִירו את הנוזל העליון. השביהו בעדינות את החרוזים ב-1 mL של Buffer B2, ולאחר מכן סובבו את הדגימות בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. הסִירו שוב את הנוזל העליון באמצעות המעמד המגנטי למבחנות מיקרוצנטריפוגה.

בשלב זה, השעו בעדינות את החרוזים ב-1 מיליטר של Buffer B3 וסובבו בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר הסרת הנוזל העליון מתערובת החרוזים באמצעות המגנט, השעו את החרוזים ב-50 µL של 2x Laemmli sample buffer כדי להבליט (elute) קומפלקסים של DNA וחלבון. לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות.

ערבבו את התערובת במכשיר Vortex לפני ספינטור מהיר של הדגימות במיקרופוגה. הניחו את הדגימות על המגנט והעבירו את התסנן למבחנה חדשה. לבסוף, בצעו הקפאה מהירה (flash freeze) לדגימות ואחסנו אותן ב-80 degrees celsius.

בצעו את ניתוח החלבון כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.