אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 5:13 דק׳ • August 31st, 2026
קח את גרעיני התאים המכילים גנומים ויראליים, המסומנים עם נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין.
השעו את הגרעינים בתערובת של biotin-azide ויוני נחושת, והדגירו.
יון הנחושת מסייע בקשירה הקוולנטית של קבוצת האזיד והאלקין.
סנטריפוג את התמיסה והסר את הנוזל העליון (supernatant).
השעה מחדש בבופר, העבר וסב בצנטריפוגה להשקה.
הקפיאו במהירות (Flash-freeze), ולאחר מכן הפשיתו את המשקע כדי לסייע בליסיס.
שחזרו את הסספנסיה ובצעו סוניקציה כדי ללוס את הגרעינים.
סבבו בצנטריפוגה ואספו את העלייה המכילה קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי.
סננו את העילאי כדי להסיר מזהמים.
דללו את התסנין.
הוסיפו חרוזי מגנט מצופים בסטפטאבידין והדגירו כדי להקל על הקשירה למתחמי חלבון-DNA ביוטיניליים.
הפעיל שדה מגנטי כדי לאסוף את החרוזים, ושטוף כדי להסיר מזהמים.
חזור על השטיפה.
הוסיפו בופר אלוציה וחממו כדי להפריד ולהשכיב (denature) את החלבונים.
הפרידו את החרוזיים ואספו את התוצרי השטיפה (eluate).
הקפיאו במהירות (Flash-freeze) את החלבונים שבודדו. אחסנו בטמפרטורות נמוכות מאוד לצורך ניתוחים המשך.
לאחר הסרה מלאה של ה-PBS, השעה מחדש את משקע הגרעינים ב-10 milliliters של תערובת לתגובת קליק, על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה חמש פעמים באמצעות פיפט של 10 milliliters. סובב את הדגימה במשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבעה degree celsius, לפני השקיעה של הגרעינים כפי שבוצע
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים