טיהור של וקטורים אדנו-ויראליים המכילים גנום באמצעות צסיום כלוריד

התחל עם תאי יונקים שהודבקו באדנווירוס.

בצע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים כדי ללוות את התאים ולשחרר את הוויריונים.

סבב את הליזאט בצנטריפוגה כדי לשקיע את השאריות. אסוף את supernatant המכיל את החלקיקים הוויראליים.

הנח את העל-נוזל הווירוסלי על גבי מדרג של cesium chloride להפרדה מבוססת צפיפות.

אולטרה-צנטריפוגה כדי לאפשר לחלקיקי הנגיף לנדוד בהתאם לצפיפות הציפה שלהם.

ויריונים שלמים המכילים את הגנום האדנו-ויראלי המלא הם דחוסים יותר בשל ה-DNA הארוז ושוקעים לפס תחתוני, בעוד שקפסידים ריקים וקלים יותר ושאריות נותרים בשכבות העליונות.

הסיר את השכבות העליונות. אסוף את הפס התחתון של ה-virions המכילים גנום.

יש להשעות מחדש את הוויריונים בקיסריום כלוריד בעל צפיפות אחידה ולבצע סבב נוסף של אולטרה-צנטריפוגציה כדי לדייק את ההפרדה ולרכז את החלקיקים המלאים.

השליכו את השכבות העליונות והפיקו את הפס התחתון.

בצע דיאליזה לדגימה כדי להסיר את הצסיום כלוריד.

הווקטורים האדנו-ויראליים בעלי הטוהר הגבוה המכילים את הגנום מוכנים כעת ליישומים המשכיים.

כדי להכין את הליזט הוויראלי לטיהור במדרג צסיום כלוריד, בצעו הפשרה והקפאה של תרחיף התאי-נגיף ארבע פעמים. לאחר מכן, סבבו את הליזט הוויראלי בצנטריפוגה ב-500 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, אספו את העלייה המכילה את האדנווירוס בעל הקיבולת הגבוהה. העבירו בזהירות ובאיטיות בעזרת פיפטה תמיסות צסיום כלוריד לשפופרות בסדר הבא: 0.5 milliliters של תמיסה בריכוז 1.5 grams per cubic centimeter, שלושה milliliters של תמיסה בריכוז 1.35 grams per cubic centimeter ו-3.5 milliliters של תמיסה בריכוז 1.25 grams per cubic centimeter. הוסיפו כשכבה עליונה כ-4.5 milliliters של העלייה המזוקקת של הווקטור מעל השכבה של 1.25 grams per cubic centimeter.

סובב את הגרדיאנטים באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור swing out בטמפרטורה של 12 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות ב-226,000 ×g, כדי להפריד את החלקיקים הוויראליים המכילים את הגנום של האדנווירוס בעל הקיבולת הגבוהה מחלקיקים ריקים ומשאריות תאים. לאחר הצנטריפוגציה, נוצר פס מפוזר של שאריות תאים בחלק העליון של המבחנות. מתחתיו, ניתן להבחין בשני פסים לבנים.

הפס העליון מכיל חלקיקים ריקים, בעוד שהפס התחתון הוא האדנו-וירוס בעל הקיבולת הגבוהה. הסרו בזהירות את השכבות של שאריות התאים והחלקיקים הריקים. לאחר מכן, אספו מיליליטר אחד מהפסים התחתונים מכל מבחנה.

העבירו את הווירוס למבחנה סטרילית של 50 מיליליטר. הוסיפו עד 24 מיליליטר של תמיסת cesium chloride בריכוז 1.35 גרם לסמ"ק לחלקיקי הווירוס שנאספו וערבבו בעדינות. מלאו את מבחנות הצנטריפוגה עד למעלה בתמיסת וירוס של cesium chloride בריכוז 1.35 גרם לסמ"ק.

לאחר מכן, סבב במרכזפוגה למשך הלילה במהירות של 226,000 ×g בטמפרטורה של 12 °C באולטרה-צנטריפוגה עם רוטור מסוג swing-out, תוך שימוש בהאצה ובבלימה איטיות. הסר את השכבות העליונות מהחלק העליון באמצעות פיפטה. לאחר מכן, אסוף את ה-adenovirus בעל הקיבולת הגבוהה הנמצא בפס התחתון הבולט באמצעות טיפ פיפטה חדש.

לבסוף, בצעו דיאליזה לחלקיקי הווירוס שנאספו לצורך החלפת תמיסת סניפ (buffer). לאחר מכן, קבעו את הטיטר של התכשיר הסופי בהתאם להוראות המפורטות בפרוטוקול הכתוב.