אישור טרנסדוקציה ויראלית בכבד חולדה שעבר רסלולריזציה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית

התחל עם רקמת כבד חולדה שעברה רסלולריזציה והוקפאה, המכילה הפטוציטים אנושיים, ומוטמעת בתווך הקפאה (cryomedium).

ברקמה זו, ההפטוציטים שעברו טרנסדוקציה מבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק (EmGFP), חלבון דגל (reporter protein) המקודד על ידי הווקטור הויראלי.

השתמש במיקרוטום קירור (cryotome) כדי לחתוך סנשנים דקים השומרים על המבנה התאי והרקמתי. העבר את הסנשנים לעלית.

טפל בחתכים באמצעות חומר ניקוי עדין כדי להגדיל את חדירות ממברנת התא.

יש להוסיף נוגדן ראשוני anti-EmGFP הנקשר באופן ספציפי לחלבון הדגל הפלואורסצנטי המבוטא בתאים שעברו טרנסדוקציה.

שטוף כדי להסיר נוגדנים שאינם קשורים.

הוסיפו נוגדן משני המצומד לפלואורופור אדום, הנקשר לנוגדן הראשוני, ולאחר מכן שטפו.

הוסף צבע פלואורסצנטי כחול ספציפי ל-DNA הנקשר ל-DNA תאי.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, קולוקליזציה של פלואורסצנציה אדומה עם גרעינים שצבעו בכחול מאשרת שההפטוציטים שהועברו להם וקטורים (transduced) ברקמת הכבד מבטאים בהצלחה את חלבון הדוח (reporter protein) הוויראלי.

בעזרת סכין מנתחים, חתכו דגימות מכל אונת כבד בעובי של כחצי סנטימטר ובאורך של 1.5 עד 2 סנטימטרים. הדגירו את הפרוסות ב-4% paraformaldehyde עם 4% sucrose למשך 90 דקות ב-4 °C.

לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים ב-PBS למשך דקה אחת לכל שטיפה. לאחר השטיפות, הדגימו את הדגימות לדגירה למשך לילה בסוכרוז 8% בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, העבירו את הדגימות לתבניות הקפאה (cryomolds) המכילות מעט תוך כיבוע.

הימנעו מהכנסת בועות אוויר. לאחר הטעינה, כסו את הדגימות באופן מלא בתווך קיבוע והניחו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, הכינו חתכים קפואים (cryosections) בעובי 10 מיקרון מהדגימות באמצעות קריוטום (cryotome).

צבע את הדגימות לפי הצורך כדי לאשש את הרצלוולריזציה (recellularization).