אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:33 דק׳ • August 31st, 2026
קח תרבית תאים אנושית.
הוסיפו לנטיווירוסים המקודדים ל-shRNA מותנה המכוון ל-mRNA של המארח, תחת פרומוטור המגיב לתטרה ציקלין המחובר לאופרטור.
הלנטיווירוס נושא גם גנים עבור רפרסור טטרהציקלין (tetracycline repressor) וחלבון עמיד לאנטיביוטיקה, הממוקמים תחת פרומוטור קונסטיטיבי.
הדגרירו כדי לאפשר את העברת ה-RNA הוויראלי לתאי המארח.
ה-RNA הופך ל-cDNA ונשלב בגנום המארח.
שטפו, הוסיפו מצע דגימה והדגירו כדי לאפשר ביטוי של מדכא הטטרציקלין (tetracycline repressor) ושל חלבון העמידות לאנטיביוטיקה, ובכך ייוצרו תאים שעברו טרנסדוקציה. מדכא הטטרציקלין נקשר לאופרטור ומדכא את ביטוי ה-shRNA.
שטוף, הוסף מצע מועשר באנטיביוטיקה והדגר.
תאים שעברו טרנסדוקציה מבטאים את חלבון העמידות לאנטיביוטיקה, מה שמאפשר את הישרדותם הסלקטיבית בנוכחות האנטיביוטיקה.
הוסיפו לדעיקה דוקסיציקלין (doxycycline), אנלוג של טטרהציקלין.
דוקסיציקלין נקשר למדכא הטטרציקלין, מונע את קישوره לאופרטור ומאפשר את ביטוי ה-shRNA.
ה-shRNA מעובד ל-siRNA, אשר נטען אל RISC ומפרק את ה-mRNA של המטרה.
פעולה זו יוצרת תאי knockdown מותנים התלויים ב-doxycycline.
כדי ליצור תאי קו יציבים, התחילו בזריעה של תאי סרטן מעי גס HCT-16 ותאי סרטן שד MDA-MB-231 לתוך פלטת 12 בארות, בריכוז של 50,0 תאים לכל בארה.
הדגירה תתבצע ב-37 °C וב-5% CO2. כאשר התאים יגיעו ל-60-70% התמסגרויות (conf
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים