JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:51 דק' • August 31st, 2026
השתמשו בווקטורים לנטיביריאליים המכילים אנטיגן HIV-1 p24, חלבון המשמש כסמן לזיהוי.
הוסף דטרגנט כדי ללוות ולשחרר p24, ולאחר מכן בצע דילול סדרתי של הדגימה.
קחו מיקרופלטה מצופה בנוגדנים מונוקלונליים ל-anti-p24 ובחומר חסימה למניעת קישור לא ספציפי.
הוסף את מהולי הדגימות ואת סטנדרטי ה-p24 כביקורות.
דגרו את הדגימות כדי לאפשר אינטראקציה של p24 עם הנוגדנים באמצעות an epitope ספציפי, ולאחר מכן הסירו רכיבים שאינם קשורים.
דגרו עם נוגדנים פוליקלונליים נגד p24 הנקשרים לאפיטופים שונים על p24. הסירו נוגדנים שאינם קשורים.
הוסף נוגדנים המקושרים לפרוקסידאז הנקשרים לנוגדנים הפוליקלונליים. הסר נוגדנים שאינם קשורים.
הוסף מצע פראוקסידאז שהופך למוצר צבעוני.
הוסיפו חומצה כדי להשבית את הפרוקסידאז ולייצב את התוצר.
מדדו את הבליעה (absorbance) התואמת לעוצמת הצבע, שהיא פרופורציונלית לריכוז ה-p24.
הפיקו את גרף התקן והעריכו את ריכוזי הדגימות כדי לקבוע את התור הוויראלי.
צפו פלטת 96 באערים בעלת קישוריות גבוהה (high-binding) ב-100 µL של נוגדן מונוקלונלי anti-p24 בדילול של 1:1,500, בהתאם להנחיות ה-NIH AIDS vaccine program עבור ערכה לבדיקת לכידת אנטיגן HIV-1 p24. הדגרירו את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שטפו את הפלטה שלוש פעמים עם 200 µL של 0.05% TWEEN-20 ב-PBS קר.
כדי למנוע קישור לא ספציפי, חסמו את הפלטה עם 200 microliters של 1% bovine serum albumin למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הפלטה עם 200 microliters של 0.05% TWEEN-20 ב-PBS קר שלוש פעמים. לאחר מכן, הכינו את דגימות הווקטור המרוכזות והלא-מרוכזות לריכוז סופי של 10% על ידי דילול הווקטור במים מזוקקים כפולה (double-distilled water) וב-Triton X-100.
לאחר מכן, הכינו את סטנדרטי ה-HIV-1 באמצעות דילול סדרתי פי שניים, החל מריכוז של 5 ng/mL. לאחר דילול דגימות הווקטור המרוכזות והבלתי-מרוכזות, העבירו אותן בפיפט לצלחת בשלישייה (triplicates) והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. למחרת, שטפו את הצלחת, ולאחר מכן הוסיפו 100 µL של נוגדן שפנאי פוליקלונלי anti-p24 לכל באער והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות.
לאחר שישה שטיפות, דגרו את הפלטה עם נוגדן goat anti-rabbit horseradish peroxidase בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר שטיפות מרובות, דגרו את הפלטה עם תסבסב TMB peroxidase בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הוסיפו 1 N HCl כדי לעצור את התגובה. מדידו את הבליעה באורך גל של 450 nm באמצעות קורא פלטות (absorbance plate reader).