ייצור של נגיף אדנו-אסוסיאטיבי רקומביננטי באמצעות טרנספקציית פלסמידים

התחל עם תערובת של פלסמידים המושעים בתוך מצע תזונה.

הפלסמיד הראשון נושא גנום של נגיף adeno-associated virus (AAV) רקומביננטי המקודד לגן הנחקר.

הפלסמיד השני מקודד לחלבוני ה-Rep וה-Cap.

הפלסמיד השלישי מקודד לחלבוני עזר.

הוסיפו חומר טרנספקציה לתמיסת הפלסמיד. ערבבו היטב והדגירו.

חומר הטרנספקציה בעל המטען החיובי נקשר ל-DNA הפלסמידי בעל המטען השלילי, ובכך יוצר קומפלקסים.

העבירו את הקומפלקסים לשכבה אחת של תאי יונקים. דגרו.

הקומפלקסים חודרים לתאים באמצעות אנדוציטוזה.

בתוך התאים, הגנים המקודדים בפלסמיד מניעים את הביטוי של חלבונים ויראליים.

חלבון ה-Rep משכפל את הגנום הוויראלי, בעוד שחלבוני ה-Cap יוצרים את מעטפות הקפסיד.

חלבון Rep, יחד עם חלבוני עזר, אורך את הגנום הוויראלי המשוכפל לתוך קפסידים, ובכך יוצר חלקיקי AAV שלמים.

וקטורי AAV הרקומביננטיים הנושאים את הגן המבוקש מוכנים ליישומי העברה גנטית.

לאחר יצירת קונסטרוקטים של rAAV9 ותרבית של תאי HEK293 בהתאם לפרוטוקול הכתוב, כדי לבצע טרנספקציה לתאים ביום הראשון, ערבבו 70 micrograms של פלסמיד AAV Rep-Cap, 70 micrograms של פלסמיד rAAV9 ו-200 micrograms של פלסמיד Ad helper בתוך מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliters. הוסיפו למבחנה 49 milliliters של DMEM בטמפרטורת החדר ללא FBS וערבבו היטב. לאחר מכן, כדי להכין תמיסת PEI ל-DNA ביחס של ארבעה לאחד, הוסיפו למבחנה 1,360 microliters של PEI וערבבו היטב.

דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 15 עד 30 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו חמישה מיליליטר של התמיסה לכל צלחת 150-מ"מ של תאים. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 50 עד 72 שעות.