טיהור חלקיקי נגיף רקומביננטיים מתאי כליה אנושיים שעברו טרנספקציה

התחל עם ליזט תאים המכיל DNA תאי המקובץ יחד עם חלבונים תאיים וחלקיקים ויראליים.

הוסיפו יוני מגנזיום, ולאחריהם נוקלאז, כדי להפעיל פירוק אנזימטי של DNA תאי ולפרק אגריגטים של DNA–חלבון.

סבבו בצנטריפוגה כדי להפריד את השאריות ואספו את העלון (supernatant) המכיל את חלקיקי הווירוס.

שכב את supernatant על גבי מדרג iodixanol לא רציף, שבו הריכוזים עולים מלמעלה למטה, ולאחר מכן מלא את המבחנה בבופר.

אולטרא-צנטריפוגה להפרדת הרכיבים על בסיס צפיפות. חלקיקי הנגיף מצטברים בממשק שבין השכבות בעלות הצפיפות הגבוהה והבינונית.

החדירו מחט בממשק זה ואספו את החלקיקים הויראליים אל תוך מבחנה.

הוסף בופר המכיל רכיבים מייצבים, אשר מונעים אגרגציה של חלקי הווירוס.

לאחר מכן, העבירו את התמיסה למבחנה עם מסנן ממברנה.

סב במצנטריפוגה כדי לרכז את החלקיקים הוויראליים מעל המסנן.

הוסיפו את הבאפר המועשר בחומר מייצב וסבבו שוב במערך צנטריפוגה כדי להפיק חלקי וירוס מנוקים.

כדי לקצור את התאים שעברו טרנספקציה, יש לשחרר ולהשעות את התאים באמצעות מצע גידול על ידי פיפוט למעלה ולמטה. לאחר מכן, העבירו את תרחילי התאים למבחנות סטריליות של 50 מיליטר. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-50 ×g למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליטר של PBS לכל מבחנה והחזירה לתליה את משקעי התאים לפני איחוד כל התליות במבחנה אחת של 50 מיליטר. לאחר סבב של התאים ב-50 times g למשך חמש דקות, השליכו את העילוי. כדי לטהר את ה-AAV, החזירו לתליה את המשקע ב-10 מיליטר של באפר ליזיס.

הקפיאו את הליזט בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס או באמבטיית קרח יבש ואתנול. לאחר מכן, הפשיתו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ערבבו את הליזט באמצעות וורטקס למשך דקה אחת לפני חזרה על תהליך ההקפאה וההפשרה פעמיים נוספות.

לאחר מכן, הוסיפו מגנזיום כלוריד בריכוז של 1 millimolar לליזאט שהופשר. לאחר מכן, הוסיפו נוקליאז עד לריכוז סופי של 250 units per milliliter. דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות כדי להמיס את תצלומי ה-DNA והחלבון.

סחרר את הדגימה ב-4,80 times g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, אסוף את העליון. במקביל, כדי להכין תמיסת מדרג iodixanol בריכוז 17%, ערב חמישה מיליטר של 10X PBS עם 0.05 מיליטר של מגנזיום כלוריד בריכוז מולרי אחד, 0.125 מיליטר של פוטסיום כלוריד בריכוז מולרי אחד, 10 מיליטר של נתרן כלוריד בריכוז חמישה מולרי, ו-12.5 מיליטר של מצע מדרג צפיפות.

השתמש במים כדי להביא את הנפח הכולל ל-50 milliliters. לאחר הכנת תמיסות מדרג של 25%, 40% ו-60% בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש במחט ובמזרק כדי להעביר חמישה milliliters של תמיסת מדרג 17% לשפופרת פוליפרופילן. לאחר מכן, הוסף חמישה milliliters מכל אחת מתמיסות המדרג בריכוזים 25%, 40% ו-60%.

הניחו את הליזאט מעל המדרג (gradient). לאחר מכן, מלאו את המבחנה בתמיסת ליזיס וכסו אותה בפקק שעם. סבבו את המדרג בצנטריפוגה ב-185,0 ×g ובטמפרטורה של 16 °C למשך 90 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, השתמשו במזרק כדי לאסוף את פראקציית הויראליות של 40% על ידי החדרת מחט בקוטר 21G לנקודת המפגש בין פראקציות ה-40% וה-60%, תוך הימנעות מוחלטת משכבת ה-25%. ערבבו את הפראקציה הויראלית עם תמיסת PBS של פוליאוקסיתילן פוליאוקסיפרופילן סטרילית, או קו-פולימר בלוק של PEG-PPG, עד לנפח כולל של 15 milliliters. העמיסו את התערובת לתוך צינור סינון עם סף משקל מולקולרי של 10 kilodaltons.

לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-2,00 ×g ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שפכו את התמיסה מהחלק התחתון של המבחנה. לאחר מכן, השתמשו ב-PEG-PPG כדי למלא מחדש את מבחנת הסינון עד לנפח של 15 milliliters.

סב את המבחנה בצנטריפוגה ב-2,00 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר חזרה על פעולות המילוי והסב פעמיים נוספות, אסוף את פראקציית נגיפי ה-rAAV9 המזוה שמעל המסנן.