הנצחת תאי אנדותל באמצעות טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של אונקוגנים ויראליים

קחו מצע המכיל חלקיקי רטרו-וירוס המקודדים לאונקוגנים ויראליים ולגן לעמידות לאנטיביוטיקה.

סובב את המצע בצנטריפוגה כדי להסיר שאריות תאים.

אסוף את העלייה המכילה את החלקיקים הוויראליים והעבר אותה על תרבית של תאי אנדותל.

דגרו כדי לאפשר כניסה ויראלית.

ה-RNA הוויראלי עובר תעתוק הפוך ל-DNA, אשר משתלב בגנום המארח.

הגן לעמידות לאנטיביוטיקה מייצר חלבון עמידות. האונקוגנים מייצרים חלבונים הנקשרים לחלבונים מדכאי גידול השולטים בחלוקת התאים ומבטלים את פעילותם, ובכך מאריכים את חיי התא.

החליפו את המצע במצע טרי.

דגרו שוב כדי להבטיח אינטגרציה יציבה של ה-DNA הוויראלי.

הסר את המצע ושטוף את התאים.

הוסף תמיסת פירוק אנזימטית כדי לנתק את התאים.

העבר את תרחיף התאים, סבב בצנטריפוגה והסר את העלייה.

שחזר את המשקע לסוסיפנסיה והעבר אותו לבקבוק תרבית.

הוסף אנטיביוטיקה למדיום.

רק תאים המבטאים את החלבון לעמידות לאנטיביוטיקה שורדים, ובכך נבחרים תאים שהפכו לאלמטליים על ידי חלבוני אונקוגנים ויראליים.

לאחר דגירה למשך לילה, אספו את המצע מתרבית תאי ה-PA317 והבהירו אותו על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. החליפו את מצע ה-EGM מתרבית תאי אנדותל בהסמכה של 50% ב-12 מיליליטר של מצע PA317 מובהר. דגרו את התאים למשך ארבע שעות.

לאחר מכן, החליפו 6 mL של מצע PA317 ב-6 mL של מצע EGM טרי והדגרו את התאים למשך לילה. לאחר מכן, הסירו את המצע מתרבית התאי האנדותל וספקו לתאים 12 mL של EGM טרי. המשיכו להדגיר את התאים למשך 48 שעות נוספות.

לצורך תת-תרבית של תאי אנדותל, יש להסיר את המצע ולשטוף את התאים עם 12 מיליליטר של PBS ללא קטיונים. לאחר מכן, יש להוסיף שלושה מיליליטר של תמיסה מסחרית לפירוק אנזימטי ולהדגיר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. יש להעביר את תגלוסיית התאים למבחנה קונית של 15 מיליליטר ולסבב את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר קבלת המשקע, השביו את התאים בתווך EGM טרי וחלקו את הסספנזיה באופן שווה לשלושה בקבוקי T75. התאימו את נפח התרביות ל-12 milliliters של EGM לבקבוק. לאחר מכן, הוסיפו 200 micrograms per milliliter של G418 כדי לבצע סלקציה לתאי אנדותל שעברו טרנסדוקציה.