אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 4:23 דק׳ • August 31st, 2026
התחילו עם למסContaining תאי מאכסן מזוהמים בנגיף שעברו פרמיליזציה, כאשר ה-RNAs הנגיפיים מפוזרים בין המדורים הגרעיניים והציטופלזמיים.
הוסף באפר טרום-היברידיזציה והדגר בתנאים לחים.
בבופר, רכיבי חסימה (blocking reagents) חוסמים אתרי קישור לא ספציפיים, בעוד שמעכבי RNase מנטרלים RNases ושומרים על שלמות ה-RNA.
הסר את הבאפר והוסף פרובים של אוליגו-נוקלאוטידים דנטורטיים, המסומנים ב-digoxigenin, המשלימים ל-RNA ויראלי.
דגרו בחושך כדי לאפשר היברידיזציה של הגשוש (probe) ל-RNA, ולאחר מכן שטפו שוב ושוב.
הוסיפו חומר מקבע כדי לייצב את היברידי ה-probe-RNA, ולאחר מכן שטפו באופן חוזר. הוסיפו באפר המועשר בחומר דטרה כדי לשמור על חדירות התאים.
הוסיפו נוגדן anti-digoxigenin המשוער לפלואורופור ירוק, אשר נקשר ל-digoxigenin, ולאחר מכן שטפו שוב ושוב.
קבע את התאים כדי לשמר את הקומפלקסים, ולאחר מכן שטוף שוב.
הוסף צבע קושר-DNA לצביעת הגרעינים. שטוף את עודפי הצבע מספר פעמים.
בצעו סגירה באמצעות כיסוי זכוכית (coverslip) ואטמו אותה.
תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, הדמיאו את הפלואורסצנציה הירוקה, המשקפת את התפלגות ה-RNA הוויראלי בין גרעין תא המארח לציטופלזמה.
לאחר שלושה שטיפות ב-PBS כפי שהודגם, קבעו שוב את הדגימות ב-4% formaldehyde ב-PBS למשך 10-15 דקות לפני ביצוע פרמיאביליזציה שנייה כפי שהודגם. לאחר מכן, כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי לשמר את האות הפלואורסצנטי ולמנוע פוטובליצ'ינג.
שטפו את התאים ב-2x saline sodium citrate, לפני יישום של 45 µL של תמיסת היברידיזציה. לאחר שעה אחת ב-37 °C בתא לח, הוסיפו מים מזוקקים לאוליגונוקלאוטידים ה-antisense הרלוונטיים כדי להביא את נפח הדנטורציה ל-10 µL. בצעו דנטורציה לאוליגונוקלאוטידים ב-95 °C למשך חמש דקות, לפני הוספת 35 µL של תמיסת היברידיזציה טרייה לכל סלייד.
לאחר מכן, דגרו את הדגימות במשך 10-24 שעות בתא לח, בטמפרטורה של 37 °C, כשהן מוגנות בעטיפת רדיד אלומיניום. למחרת, שטפו את התאים פעמיים למשך 10 דקות באמצעות תמיסת 2X saline sodium citrate בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שטיפה אחת ב-1X saline sodium citrate למשך 10 דקות, בטמפרטורה של 25 °C.
לאחר השטיפה האחרונה, קבעו את התאים באמצעות 4% formaldehyde מקורר מראש ב-PBS, למשך 10-15 דקות על קרח, ולאחר מכן בצעו שלוש שטיפות ב-PBS טרי. לאחר מכן, בצעו פרמיאביליזציה לדגימות כפי שהודגם, ולאחר מכן דגרו עם anti-digoxigenin-FITC ו-0.1% BSA מקורר מראש ב-PBS, למשך שעה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בתום הדגירה, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS טרי, וקבעו את הדגימות באמצעות 4% paraformaldehyde מקורר מראש ב-PBS, למשך 10-15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שלושה שטיפות ב-PBS, סמנו את הגרעינים בעזרת 0.4 µg/mL של DAPI ו-0.5% Triton-X מקורר מראש ב-PBS למשך 15 דקות על קרח, ולאחר מכן בצעו שלוש שטיפות סופיות ב-PBS. הצמידו לגלשיות חרוזי פלואורסצנציה, בהתאם לדרישות הניסוי, בתוך מדיום הרכבה מתאים. לאחר הסרת עודפי מדיום ההרכבה בעזרת מגבונים סטריליים, אטמו כיסוי זכוכית אחד לכל גלשית באמצעות מספר שכבות של לכה שקופה לציפורניים, והשתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לאשר את ביצועו המוצלח של הניסוי.
לאחר מכן ניתן לצלם את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי בתוך פרק זמן של שעה עד שבוע מרגע הקיבוע, בהגדלה של 630 פעמים.