קביעת פיזור של RNA ויראלי בתאי מאכסן באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (Fluorescence In Situ Hybridization)
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 4:23 דק׳ • August 31st, 2026
התחילו עם למסContaining תאי מאכסן מזוהמים בנגיף שעברו פרמיליזציה, כאשר ה-RNAs הנגיפיים מפוזרים בין המדורים הגרעיניים והציטופלזמיים.
הוסף באפר טרום-היברידיזציה והדגר בתנאים לחים.
בבופר, רכיבי חסימה (blocking reagents) חוסמים אתרי קישור לא ספציפיים, בעוד שמעכבי RNase מנטרלים RNases ושומרים על שלמות ה-RNA.
הסר את הבאפר והוסף פרובים של אוליגו-נוקלאוטידים דנטורטיים, המסומנים ב-digoxigenin, המשלימים ל-RNA ויראלי.
דגרו בחושך כדי לאפשר היברידיזציה של הגשוש (probe) ל-RNA, ולאחר מכן שטפו שוב ושוב.
הוסיפו חומר מקבע כדי לייצב את היברידי ה-probe-RNA, ולאחר מכן שטפו באופן חוזר. הוסיפו באפר המועשר בחומר דטרה כדי לשמור על חדירות התאים.
הוסיפו נוגדן anti-digoxigenin המשוער לפלואורופור ירוק, אשר נקשר ל-digoxigenin, ולאחר מכן שטפו שוב ושוב.
קבע את התאים כדי לשמר את הקומפלקסים, ולאחר מכן שטוף שוב.
הוסף צבע קושר-DNA לצביעת הגרעינים. שטוף את עודפי הצבע מספר פעמים.
בצעו סגירה באמצעות כיסוי זכוכית (coverslip) ואטמו אותה.
תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, הדמיאו את הפלואורסצנציה הירוקה, המשקפת את התפלגות ה-RNA הוויראלי בין גרעין תא המארח לציטופלזמה.
לאחר שלושה שטיפות ב-PBS כפי שהודגם, קבעו שוב את הדגימות ב-4% formaldehyde ב-PBS למשך 10-15 דקות לפני ביצוע פרמיאביליזציה שנייה כפי שהודגם. לאחר מכן, כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים