טיהור של וקטורים של נגיף אדנו-אסוציאטיבי (AAV) באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

התחל עם ליזט תאים מסונן המכיל וקטורים של וירוס אדנו-אסוסיאטיבי (AAV) ומזהמים ממקור התא המארח.

העבירו את הליזאט דרך עמודת זיקה מבוססת הפרין.

חלבוני הקפסיד של הנגיף נקשרים באופן אלקטרוסטטי לקבוצות ההפרין בעלות המטען השלילי.

שטפו את העמודה עם בופר כדי להסיר מזהמים שלא נקשרו.

יש להוסיף באפר המכיל דטרגנט כדי להמיס שיירי ממברנה.

שטוף שוב בעזרת הבופר ללא הדטרגנט.

הוסיפו באפר המועשר בקטיונים כדי ליצור סביבה יונית, ולאחר מכן שטפו עם באפר בעל ריכוז מלח בינוני כדי לשחרר זיהומים הקשורים באופן חלש.

הוסף באפר בעל ריכוז מלח גבוה כדי להפר את האינטראקציות בין הקפסיד להפרין ולהבצע אלוציה של החלקיקים הוויראליים.

אסוף את פראקציוני האלוציה המועשרים בחלקיקים ויראליים שלמים והעבר אותם למבחנות ריכוז צנטריפוגליות המצוידות בממברנות סינון.

סבבו את המבחנות בצנטריפוגה כדי להסיר עודפי בופר, ולאחר מכן אספו את פראקציות הווירוס המרוכזות למבחנה.

שטפו את הממברנה עם הבאפר כדי להפיק חלקיקי וירוס שנותרו ולמקסם את התנובה.

הפשיר את הליזאט הגולמי בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה.

לאחר ההפשרה, סננו אותו באמצעות מסנן 0.22 micron. מיד לפני שלבי הטיהור, בצעו פסיבציה למרכז הצנטריפוגי על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של בופר לטיפול מקדים של הסינון עבור כל עמודת heparin-Sepharose שבה נעשה שימוש. הניחו את הצינורית במשאבה פריסטלטית.

העבירו ברצף את התמיסות והמצעים. הכינו את הכרומטוגרפיה על ידי חיבור עמודת heparin-Sepharose בנפח של 5 ml לצינורות, והעבירו 25 ml של Bazell DMEM דרך העמודה. לאחר מכן, טענו 0.2 µM של הליזט הגולמי המסונן אל העמודה בקצב זרימה של טיפה אחת עד שתיים לשנייה.

שטפו את העמודה באופן רציף כדי לאלוט חמישה מיליליטר חמש פעמים עם 300 millimolar של sodium chloride HBSS, עם מגנזיום וסידן, וסמנו את חמש האלוציות כ-E1 עד E5. כאשר תהיו מוכנים, סובבו את המרכז הצנטריפוגלי המכיל את בופר הקדם-טיפול ב-900 ×g למשך שתי דקות. השליכו את הנוזל שעבר (flow-through). שטפו את מסנן המרכז הצנטריפוגלי עם ארבעה מיליליטר של HBSS עם מגנזיום וסידן על ידי סבוב ב-1000 ×g למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת האלוציה E2 למרכז הצנטריפוגלי, וסובבו ב-1000 times g למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל שעבר (flow-through). סובבבו באופן דומה את תמיסת האלוציה E3 לתוך המרכז הצנטריפוגלי עד שנפח הנגיף המרוכז יהיה בערך one milliliter.

הוצא את הווירוס המרוכז מהמרכז הצנטריפוגלי באמצעות טיפ מסונן P200, ואסוף אותו אל תוך מבחנה צנטריפוגלית סטרילית בנפח 1.5 milliliter. לאחר איסוף הווירוס, שטוף את המרכז הצנטריפוגלי עם 200 microliters של HBSS עם מגנזיום וסידן. בצע פיפטור חזק למעלה ולמטה במשך 30 שניות כדי לשחרר כל וירוס הדבוק לממברנה, ואסוף את הווירוס המרוכז לאותה מבחנה צנטריפוגלית של 1.5 milliliter.

ערבבו היטב את המבחנה.