טיהור של אינטגראז ויראלי באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין

התחל עם פראקציית אנזים אינטגראז ויראלי מופקת המכילה נוקלאזה חיידקית שארית כמזהם.

טען את הדגימה לעמודת heparin-Sepharose שעברה שיווי משקל מוקדם עם בופר קישור בעל ריכוז מלח נמוך.

בעוד התערובת עוברת דרך העמודה, האינטגראז נקשר חזק יותר לליגנד ההפרין מאשר הנוקליאז המזהם.

בשלב הבא, העלה בהדרגה את ריכוז המלח בבופר הזורם דרך העמודה.

בריכוזים נמוכים של מלח, נוקלאזות בעלות קישור חלש נשטפות ראשונות, בעוד שהאינטגראז בעל הקישור החזק נשטף מאוחר יותר בריכוזי מלח גבוהים יותר.

אספו את הפראקציות שנאלוטו בנפרד כדי להפריד את הנוקליאז המזהם מהאינטגראז.

הוסיפו באפר לדגימות SDS-PAGE לכל פרקציה וחממו כדי לדנטור את החלבונים. העמיסו את הדגימות על ג'ל SDS-PAGE ובצעו הפרדה אלקטרופורטית.

בחן את הג'ל הצבוע.

זהו את הפראקציונים המכילים פס אינטגראז בולט ללא חלבונים מזוהמים נראים לעין, דבר המעיד על טוהר גלוי.

כדי לבצע הפרדה באמצעות כרומטוגרפיית זיקה להפרין של האינטגרז של ה-prototype foamy virus, יש להפחית את ריכוז הנתרן כלורי של הדגימה ל-200 millimolar על ידי הוספת 1.5 נפחים של באפר C. לאחר מכן, טען את דגימת האינטגרז המדוללת של ה-prototype foamy virus לעמודת heparin Sepharose בקצב זרימה של 0.5 milliliters per minute עם הגבלת לחץ מקסימלית של one megapascal. לאחר שטיפת העמודה ואיסוף הגרדיינט והשטיפה הסופית, נתח את הטעינה, ה-f