ניטור ביטוי גנים ספציפי לשלב בנגיף הווקסיניה באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים

התחילו עם פלטה רב-בארים המכילה תאי יונקים שנחשפו לנגיף vaccinia רקומביננטי.

הנגיף הרקומביננטי מקודד לחלבונים פלואורסצנטיים בירוק, אדום וכחול, כאשר כל אחד מהם נשלט על ידי פרומוטור ספציפי לשלב, כדי לעקוב אחר השלבים המוקדמים, הבינוניים והמאוחרים של ביטוי הגנים, בהתאמה.

הנגיף חודר לתא באמצעות אנדוציטוזה מתווכת-רספטורים ומשחרר את הליבה הנגיפית שלו אל הציטופלזמה.

מנגנון השעתוק בליבה הוויראלית מניע ביטוי של גנים מוקדמים, המסומן בפלואורסצנציה ירוקה.

חלבונים מוקדמים ממסרים את חשיפת הגנום (uncoating), ובכך משחררים את ה-DNA הוויראלי לציטופלזמה, שם DNA polymerase משכפל את הגנום הוויראלי.

לאחר מכן, ביטוי גנים בינוני, כפי שמעידה פלואורסצנציה אדומה, מייצר גורמי שחיתוך (transcription factors) החיוניים להפעלה של גנים מאוחרים.

לאחר מכן, ביטוי של גנים מאוחרים, כפי שמעידה פלואורסצנציה כחולה, מייצר חלבונים מבניים הנחוצים ליצירת ויריונים בוגרים.

הוסיפו חומר מקבע והדגירו לזמן קצר כדי לשמר את הפלורסצנציה.

הסיר את המקבע, ולאחר מכן הוסף בופר.

השתמשו בספקטרופוטומטר למדידת פלואורסצנציה ולכימות ביטוי גנים ויראליים ספציפיים לשלב בתאים נגועים.

התחילו את הפרוטוקול על ידי הפרדת תאי HeLa שגודלו בצלחת בקוטר 10 ס"מ. דללו את התאים במצע גידול לריכוז של כ-2.0 × 10⁵ תאים/מ"ל. לאחר מכן, העבירו 100 µl לכל באער בלוח 96 באערים בעל דפנ