בדיקה מבוססת לוציפראז להערכת תרכובות אנטי-ויראליות בתאי כליה עובריים אנושיים

התחילו עם פלטת רב-בארים המכילה דילול סדרתי של התרכובת הנבדקת כדי להעריך את הפעילות האנטי-ויראלית.

הוסיפו לכל באר תרחיף של תאי כליה עובריים אנושיים המכילים נגיף חצבת רקומביננטי המבטא לוסיפראז.

דגרו כדי לאפשר לתאים להיצמד לתחתית של כל באר.

בבאר הביקורת ללא התרכובת הנבדקת, הנגיף מתמזג עם ממברנת התא ומשחרר את הגנום שלו לתוך הציטופלזמה.

הגנום הוויראלי מכוון את ייצור ה-RNA והחלבונים הוויראליים, יחד עם חלבון הדגל לוסיפראז (luciferase).

בבארות הבדיקה, התרכובת האנטי-ויראלית מעכבת את השכפול הוויראלי, ובכך מפחיתה את ייצור הלוסיפראז.

הוסיפו לכל באער סובסטרט ספציפי ללוסיפראז, אשר מקיים אינטראקציה עם הלוסיפראז ופולט לומנסינציה.

השתמשו בקורא לוחות כדי למדוד את עוצמת הלומינסצנציה בכל באר.

לימננס (luminescence) נמוכה יותר בבאי החלפת הבדיקה בהשוואה לבאר הביקורת מעידה על עיכוב ויראלי.

ירידה הדרגתית בלומנסנס עם עלייה בריכוז התרכובת מעידה על עיכוב של השכפול הוויראלי התלוי במינון.

הוסיפו מיקרוליטר אחד מלוח דילוציות התרכובת ללוח תרביות רקמה לבן עם ברקוד. חזרו על תהליך זה פעמיים כדי ליצור סט משולש של לוחי בדיקה. לאחר מכן, מלאו את לוחי תרביות הרקמה ב-50 מיקרוליטר של מצע גידול. כעת, הכינו 37.5 מיליליטר של תרחיף תאי HEK-293T ב-DMEM מועשר בריכוז של 600,000 תאים למיליליטר.

העבירו לשתי מבחנות של 15 מיליליטר 12.5 מיליליטר