מיון מבוסס פלואורסצנציה של חלקיקי וירוס בודדים לצורך אנליזה גנומית

קחו סספנזיה המכילה תערובת מגוונת של וירוסים, יחד עם מזהמים כגון חלקיקים ויראליים פגומים החסרים חומצות גרעין.

וירוסים אלו נצבעים מראש בצבע פלואורסצנטי הנקשר לחומצות גרעין, כדי להבדיל בין וירוסים בעלי גנום לבין מזהמים.

העבירו את הסספנסיה דרך מנתק תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), שבו כל חלקיק מנותח עבור פיזור אור ועוצמת פלואורסצנציה.

אות פיזור האור משקף את גודל החלקיק, בעוד שעוצמת הפלואורסצנציה מעידה על תכולת החומצות הגרעיניות.

יש להחריג מזהמים שאינם מראים פלואורסצנציה ואגריגטים המראים פלואורסצנציה גבוהה באופן חריג.

בחרו חלקיקי נגיף בודדים המכילים גנום ומיינו אותם ישירות על גבי זכוכית עם תאי קיבוע מצופה באגרוז לצורך קיבוע.

כסו כל באער באגרוזה נוספת כדי להטמיע את הווירוסים.

אלה מוכנים כעת להגברה וניתוח של גנום של וירוס בודד.

למיון וירוסים באמצעות ציטומטר זרימה המצויד במכפילים פוטו-אלקטריים (PMT) ייעודיים לפיזור קדמי או FSC-PMT. התחילו בדילול של החלקיקים הויראליים ב-Tris-EDTA מסונן ב-0.1 micron. עבור תערובת המכילה חלקיקי פאג' T4 ולמבדה, הגדירו את ה-FSC-PMT ל-1000 ואת ה-SSC ל-200 כדי למקסם את יחס האות לרעש.

לאחר הרצת דגימות ביקורת, הריצו כ-100 מיקרוליטר של התוך הוויראלי הצבוע עד להגעה לסך של 5,000 אירועים. לאחר מכן, השתמשו בתרשימי ה-SYBR Green I וה-FSC-PMT כדי להגדיר שער (gate) צפוף במרכז החלקיקים