זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון וריאנטים ספציפיים בחלבון BRCA1 באמצעות בדיקת רקומבינציה הומולוגית in vitro. דבר זה מושג על ידי החלפת חלבון ה-BRCA1 מסוג הבר (wild type) האנדוגני בווריאנט הנבדק, באמצעות טרנספקציה של RNA מפריע קצר (siRNA) הספציפי ל-BRCA1 ושל פלסמיד לביטוי מחדש של חלבוני וריאנט BRCA1 הנבדקים בתאים; כשלב שני, ה-siRNA והפלסמיד לביטוי BRCA1 מוטנטי מוחדרים יחד עם פלסמיד לביטוי חלבון ICN1, הגורם לנזק ל-DNA באתר ספציפי בגנום ה-DNA של התא הנבדק. לאחר מכן, התאים מדגברים במשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר לנזק ל-DNA ולתיקונו להתרחש. התוצאות המתקבלות מראות האם וריאנטים ספציפיים של חלבון ה-BRCA1 מתפקדים בתיקון DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, בהתבסס על ניתוח בציטומטריה של זרימה (flow cytometry) של תאים המבטאים GFP.

טכניקה זו משלבת שתי שיטות מבוססות על מנת ליצור מערכת ורסטילית לניתוח וריאנטים ספציפיים של חלבונים בתיקון נזקי DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא ששיטות שפותחו בעבר התבססו על שורות תאים עם נוק-אאוט גנטי של BRCA1. אנו משתמשים בשורת תאים ניתנת לניהול קל יותר, שנגזרת מתאי HELOC, המאפשרת דפלציה של BRCA1 באמצעות RNA interference של החלבון האנדוגני והחזרת חלבון בדיקה לתאים אלה.

כעת, כאשר אנו מבטאים חלבון BRC1 וריאנט, ניתן לבחון רקומבינציה הומולוגית. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בשל מוות תאי מוגבר במהלך הפרוצדורה. חשוב לקבוע בקפידה תנאי חיתוך (transection) שימקסמו את השפעת תגובת הרקומבינציה תוך הגבלת הציטוטוקסיות.

לפני תחילת פרוטוקול זה, קו התאים hela DR 13 הוקם על ידי טרנספקציה של תאי hela עם P-D-R-G-F-P. יש לתחזק את קו התאים בצלחות פטרי בקוטר 10 סנטימטרים בתוספת pur mycin לצורך סלקציה של תאים שעברו טרנספקציה יציבה. תַּבסיר הרקומבינציה בפלסמיד P-D-R-G-F-P ובטרנספורמנטים היציבים מכיל שני אללים לא פעילים של GFP. אלל אחד אינו פעיל עקב הכללה של אתר זיהוי של אנזים הגבלה באורך 18 זוגות בסיסים עבור ISCE one.

ברצף הקידוד שלו, ביטוי של ISCE one בתאים אלו יוצר שבירה של DNA דה-דו-גדילי או DSB באלל השני של GFP לא פעיל. חלק הרצף המתואם עם אתר I SCE E one באלל הראשון הוא מסוג בר (wild type). אלל GFP שני זה יכול לשמש כתור רצף עבור תיקון של ה-DSP באמצעות רקומבינציה הומולוגית, דבר שיוביל לאלל GFP פעיל, שניתן לזהותו בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה ביום שלפני הטרנספקציה הראשונה.

השג צלחת של 10 סנטימטר עם תאי hela DR 13 המגיעים לרמת התמזגות (confluency) של 90% לפחות. בצע עיכול של התאים באמצעות טריפסין בנפח של 1 מיליליטר למשך שתיים עד שלוש דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 9 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S וערבב היטב את תרחיף התאים באמצעות פיפטה. העבר 40 מיקרוליטר של תאים שעברו טריפסינזציה לכל באער של פלטת 24 באערים בתוך 0.5 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S. הדגר את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך לילה.

ביום הראשון, התאים צריכים להיות בקונופלואנס (confluence) של בין 40% ל-50%. התחילו את התעתוק (transfection) על ידי ערבוב של ה-irna להדליית b RCA one אנדוגנית והפלסמיד המבטא את מוטנט ה-B RCA one בתווך optimum media. לאחר מכן, שלבו את חומצות הגרעין עם lip בתווך optimum media.

בצע את הטרנספקציה באמצעות ליפוקטומיה בהתאם להוראות היצרן לאחר הטרנספקציה. החזר את התאים לדגירה. החלף את המצע לאחר ארבע עד שש שעות במצע שאינו מכיל אנטיביוטיקה.

החזירו את התאים לדגירה למשך לילה ביום השני. כדי לבצע טריפסינציה לתאים, הוסיפו 0.3 milliliters של ריאגנט trip le trypsin לכל באר; לאחר דגירה קצרה ב-37 degrees Celsius, שחררו את התאים על ידי פיפטור של התאים למעלה ולמטה בתוך ריאגנט הטרפסין. ברגע שהטרפסין פעל, העבירו את התאים מלוח ה-24 באר ללוח של 6 בארים המכיל two milliliters של D-M-E-M-F-B-S כדי לעצור את פעילות הטרפסין.

השאירו את הפלטה בעלת ששת הבארים להדגרה למשך לילה תחת אותם תנאים כפי שבוצע יומיים לאחר הטרנספקציה הראשונית. הכינו את ה-SIR A, את ה-DNA הפלסמי המבטא את המוטציה BRCA one ואת הפלסמיד המבטא את ISCE one ב-62.5 µL של Optum. ערבבו תמיסה זו עם 2.5 µL של LIPECTOMY 2060 ו-2.5 µL של Optum.

יש לבצע טרנספקציה לתאים לאחר דגירה של ארבע עד שש שעות. יש להחליף את המצע ב-D-M-E-M-F-P-S ללא אנטיביוטיקה. החזירו את התאים לאינקובטור ביום השישי.

בצעו טריפסינציה לתאים בכל באר על ידי הוספה של 0.5 milliliters של תמיסת טריפסין. עצרו את התגובה על ידי הוספה של שני milliliters של D-M-E-M-F-B-S. אספו את התאים על ידי סרקיגציה במהירות של 1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השביו את התאים במיליליטר אחד של D-M-E-M-F-B-S טרי. נתחו 10,000 תאים לבאר לבדיקת ביטוי GFP.

באמצעות ציטומטריית זרימה, תאים חיים בודדים מופרדים (gated) באמצעות פרמטרים של פיזור קדימה (forward scatter) וגודל. תאים חיוביים ל-GFP מבודלים באמצעות גלאי פלואורסצנציית GFP והתוצאות מוצגות כהיסטוגרמה. ניתן לזרוע מחדש את שאר התאים לצורך צילום פלואורסצנציה.

מיקרוסקופיה של BRCA1 הרצוי מווסתת את המסלול לתיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. תאים שעברו תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. דילול של BRCA1 באמצעות RNAi גורם לירידה חדה במספר התאים החיוביים ל-GFP שזוהו.

הפלט מה-FCA הוא היסטוגרמה שבה עצימות ה-GFP לכל תא מופיעה על ציר ה-x ומספר התאים על ציר ה-Y. בהיעדר טרנספקציה של פלסמיד ביטוי ב-I SCE, לא מזוהים תאים חיוביים ל-GFP.

התוצאות בעמודות שתיים עד שש נלקחו כולן מתאים שבהם בוצע טרנספקציה של פלסמיד המבטא ISC one ביום השלישי. בסט טיפוסי של תוצאות מניסוי בודד, 15.5% מהתאים הם GFP חיוביים לאחר ביטוי של I SCE one ודילול RNAi של ביקורת עבור גן לא רלוונטי; לשם השוואה, דילול של BRCA one והוספה של וקטור פלסמיד ריק הפחיתו את המרת ה-GFP ל-0.7%. הוספה של BRCA one חיצוני מסוג wildtype שיחזרה באופן מלא את הרקומבינציה ההומולוגית, כפי שזוזוהה על ידי השגת 15 עד 16% תאים חיוביים ל-GFP.

באופן דומה, ביטוי של וריאנט אחר בעל משמעות לא ידועה. מוטציית ה-BRCA one I 21 B שחזרה באופן מלא את תפקוד הרקומבינציה ההומולוגית התלוי ב-BRCA one. להוספה חזרה של המוטנט BRCA one M 18 T הייתה השפעה דומה לזו של בקרת הווקטור.

היות שוריאנט זה ביטא רמות דומות לאלו של החלבון האנדוגני, הדבר מרמז כי הווריאנט BRCA one M 18 T אינו תפקודי ברקומינציה הומולוגית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנטר את צמיחת התאים, שכן התאים גדלים לאט ובצפיפות (confluency) נמוכה, ויש להפחית את כמות תערובת הטרנספקציה שבה משתמשים. כמו כן, חשוב להסיר את מצע הטרנספקציה במועד.

מצאנו כי בימים שלאחר הטרנספקציה קיימת רמה גבוהה של ציטוטוקסיות כאשר אנטיביוטיקה כלולה במצע. מסיבה זו, כל המצע לאחר היום הראשון אינו מכיל אנטיביוטיקה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר סרטן השד לבחון את הגנטיקה של וריאנטים של BRC1 בעלי משמעות קלינית לא ידועה במרפאות לסרטן.

אנו מקווים כי בדיקת ה-BRC one הפונקציונלית שפותחה בעבודה זו תאפשר חיזוי משופר של השפעותיהם של וריאנטים ב-BRC one על הנטייה לסרטן.