Name: זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למדו לבדוק וריאנטים של BRCA1 ברקומבינציה הומולוגית באמצעות RNAi וזרימה ציטומטרית בתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד DNA תיקון במחקר סרטן השד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מרכז אוהיו מקיף אוניברסיטת סרטן למתן מימון עבור עבודה זו.

1. Cell קו עם המצע רקומבינציה משולב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים הלה הפכו ביציבות עם PDR-GFP (מתנה פלסמיד 7 מ מ Jasin, ממוריאל סלואן קטרינג Cancer Center) ומתוחזק puromycin לבחירת transformants. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים passaged ב DMEM / FBS, המכיל 10% בסרום שור עוברית, 2 מ"מ GlutaMAX, נתרן 1 mM pyruvate, פניצילין / סטרפטומיצין (100 U / mL/0.1 מ"ג / מ"ל), ו 1.5 UG / mL puromycin. </li></ol> המצע רקומבינציה ב-GFP-PDR הפלסמיד, וב transformants יציבה, מכיל שני אללים פעיל של ה-GFP (איור 1). אחת אלל אינו פעיל עקב הכללת ברצף קידוד של האתר 18 נ"ב אנזים הכרה הגבלה עבור I-SCEI. הביטוי של I-SCEI בתאים אלה יוצר לשבור פעמיים גדילי דנ"א (DSB). יש האלל השני של ה-GFP פעיל על ה-DNA הזה, אבל את החלק של הרצף שלה בקורלציה עם האתר I-SCEI על האלל הראשון הוא wild-type. זה האלל GFP השני יכול לתפקד בתור התורם רצף לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של DSB ו תביא אלל GFP פעיל, אשר מזוהה בקלות על ידי cytometry הזרימה. לחלופין, DSB יכול להיות מתוקן על ידי nonhomologous סוף להצטרף, אשר יהרוס את האתר I-SCEI הגבלה תגרום GFP שלילי תאים. רמת רקומבינציה הומולוגיים בתא נקבע על ידי ספירת אחוז GFP חיובי תאים. קו זה התא, pHeLa-DR13-9, נבחר בין כל הכפילים לאות אפס רקע GFP ואחוז גבוה יחסית של ה-GFP חיובית על תאים transfection עם I-SCEI להביע pCBASce פלסמיד,. (PCBASce ושליטה וקטור שלה, pCAGGS, היו שניהם מסופק על ידי מ 'Jasin של מרכז הסרטן סלואן קטרינג הזיכרון). השורה הלה-DR13-9 תאים זמין המחברים על פי בקשה. 2. Transfection כדי לכלות BRCA1 אנדוגני הוסף חזור BRCA1 Mutant. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני transfection הראשונה (בדרך כלל יום שלישי): התחל עם צלחת 10 ס"מ של הלה-DR13-9 תאים לפחות 90% ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize ב 1 מ"ל ולעצור את התגובה על ידי הוספת 9 מ"ל DMEM / FBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL של תאים trypsinized היטב לכל צלחת 24 היטב מ"ל של 0.5 DME / FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 יום transfections (יום רביעי): תאים יש ~ ומחוברות 40-50%, אם הרבה פחות ולהתחיל מחדש. Transfect על ידי ערבוב: 5 siRNA pmol + 0.3 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה ב 12.5 μL Opti-ממ, ו 0.5 Lipofectamine μL 2000 ב 12.5 μL Opti-ממ. המשך transfection על פי פרוטוקול Lipofectamine (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר. SiRNA אנו משתמשים כדי לרוקן BRCA1 מבוסס על GCUCCUCUCACUCUUCAGU רצף ציון BRCA1 3'-UTR רצפים 80,780 עד 80,798 (מספר ההצטרפות AY273801). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: העברת התאים על ידי trypsinizing מהצלחת גם 24 לצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 יום transfections: 25 siRNA pmol + 0.75 UG BRCA1-DNA פלסמיד המבטא מוטציה + 0.75 pCBASce UG (או שליטה pCAGGS וקטור) ב 62.5 μL Opti-ממ ו 2.5 Lipofectamine μL 2000 ב 62.5 μL Opti-ממ. החלף את המדיה 4-6 שעות מאוחר יותר. </li></ol> 3. ניתוח Transfectants. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 6, trypsinize התאים היטב כל עצירה 1 מ"ל DMEM / FBS. ניתוח תאים לביטוי GFP יכול להיעשות על 5 או 7 ימים, אך אנו מוצאים כי ביום 6 עובד הכי טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח 10,000 תאים לכל היטב על ידי cytometry הזרימה. אנו משתמשים בכלי בקטון דיקינסון FACSCalibur של אוניברסיטת מדינת אוהיו מקיף סרטן משאב מרכז אנליטי cytometry משותף. יחיד, תאים חיים הם מגודרת באמצעות פרמטרים פיזור קדימה בצד. GFP חיובי תאים מזוהים באמצעות גלאי הקרינה GFP (FL1), והתוצאות מוצגות היסטוגרמה (איור 2, למטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השמאל על התאים ניתן replated לצילום על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אם תרצה בכך. </li></ol> 4. נציג תוצאות: BRCA1 מסדיר את מסלול תיקון של DNA גדילי כפול נשבר על ידי רקומבינציה הומולוגיים 6,11. תאים אלה אשר עברו תיקון ע"י רקומבינציה הומולוגיים מזוהים בקלות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2, למעלה). דלדול של תוצאות BRCA1 לירידה GFP חיובי זיהה התאים (איור 2, מימין). התפוקה של FACSCalibur היא היסטוגרמה בעוצמה GFP לכל תא על ציר ה-X ואת מספר התאים על ציר Y (איור 2, למטה). בכל קבוצה טיפוסית של תוצאות מניסוי אחד, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי לאחר I-SCEI ביטוי ושליטה דלדול RNAi (איור 3). לשם השוואה, דלדול של BRCA1 ו - וקטור להוסיף מופחת בחזרה GFP המרה ל 0.7%. תוספות האחורי של BRCA1 wild-type או של רקומבינציה BRCA1 (I21V) הומולוגיים שוחזר במלואו, כפי שזוהו על ידי השגת 15-16% GFP חיובי תאים. תוספות האחורי של (BRCA1 M18T) מוטציה (איור 3, מסלול 5) היתה השפעה דומה לזו של התוספת האחורי של שליטה וקטור. מאז גרסה זו מתבטאת ברמות דומות כמו חלבון אנדוגני 9, ולכן אנו מפרשים את וריאנט (M18T) BRCA1 הוא לא פונקציונלי רקומבינציה הומולוגיים. אנחנו בדרך כלל יש 10-20% של התאים להמיר את ה-GFP חיובי לאחר transfecting הביטוי I-SCEI פלסמיד. דלדול של BRCA1 reproducibly מפחית את ההמרה של ה-GFP חיובי תאים על ידי קיפול על 8-10. למרות אחוזי בפועל של ה-GFP חיובי תאים עשויים להשתנות מניסוי לניסוי, יחס חיובי של ה-GFP בתאים בעקבות דלדול BRCA1 דלדול יחסי שליטה בתוך ניסוי עקבי למדי. אנו לנרמל את התוצאות על ידי קביעת שיעור ההמרה מעצורים עד 100% והתוצאות להביע עם depletions BRCA1 ו התוספת הגב באחוזים. בדרך זו, אנו יכולים לשלב מספר רב של ניסויים, ואת וריאציה הניסוי אינה גבוהה. הוסף האחורי של מוטציות BRCA1 עד כה הניבו תוצאות חזקות: כל גרסה יש BRCA1 או שמלוא הפעילות הומולוגיים רקומבינציה או יש לו כל השפעה. שיקול חשוב בהשגת התוצאות הללו היא כי התנאים transfection שלנו לייצר רמות של החלבון BRCA1 כי כ שווה את הריכוז של חלבון אנדוגני בתאים שלא טופלו. גבוה מדי של overexpression של מוטציה של BRCA1 פגום אפילו עלול לגרום פעילות כלשהי הומולוגיים חיובי רקומבינציה. הבעיה שאנחנו צריכים להתגבר היה את הרעילות של transfection. דלדול של BRCA1 עצמה יכול להאט צמיחת תאים, ואת היתרה של ה-DNA Lipofectamine-2000 ו - פלסמיד ביחס למספר התאים על צלחת חייב להתקיים ברמה עקבית. דנ"א מדי Lipofectamine הרבה או פלסמיד תפחית מספרים סלולריים, את מספר התאים יהיה מספיק כדי לקבל תוצאות אמינות cytometry הזרימה. יתרת ריאגנטים פלסמיד ו Lipofectamine לעומת מספר של תאים transfected חשוב מאוד לשמור על יכולת הקיום של התאים. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. המצע רקומבינציה. האסטרטגיה אשר פותחה על ידי קבוצה של מ Jasin 7,12 מתואר. PDR-GFP פלסמיד המכיל שני אללים פגומים של ה-GFP, אשר אחד מהם מכיל I-SCEI endonuclease אתר הגבלה. שורת תאים הנגזרים הלה מכיל זה המצע DNA משולב באתר יחיד הגנום 9, ותיקון פעיל לשבור פעמיים תקועים ה-DNA באתר I-SCEI על ידי הומולוגיים תוצאות רקומבינציה בהמרה של אלל אחד GFP חיובי. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. גילוי ה-GFP חיובי תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאים נבדקו לפי פרוטוקול זה, שליטה מתרוקנים התאים היו פעילים רקומבינציה הומולוגיים, זוהה על ידי אחוז גבוה של תאים עם ביטוי של GFP (משמאל). דלדול של BRCA1 על ידי תוצאות RNAi לירידה חדה במספר של ה-GFP חיובי תאים (מימין). <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תוצאות של התוספת האחורי של מוטציות BRCA1 missense. תוצאות מניסוי בודד מוצגים היסטוגרמה זו. בהעדר transfected I-SCEI להביע פלסמיד (מסלול 1) אין GFP חיובי תאים זוהה. התוצאות במסלולים 2-6 נלקחו כל מתאי שבו אני מביע-SCEI הפלסמיד היה transfected ביום 3. בתאים שהיו מרוקנים עבור גן רלוונטית (בלוציפראז) ועם וקטור התוספת בחזרה, 15.5% מכלל התאים היו GFP חיובי (מסלול 2). דלדול של BRCA1 ו - וקטור התוספת בחזרה חושף את ההשפעה של אובדן BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים (מסלול 3). ההשפעות של דלדול של BRCA1 ו התוספת האחורי של BRCA1 wild-type (מסלול 4), BRCA1 (M18T) (מסלול 5), BRCA1 (I21V) (מסלול 6) מוצגים. תוצאות אלו מניסוי אחד, יהיה משולב עם לפחות שני ניסויים חוזרים יותר כדי להשיג מידה של רקומבינציה הומולוגיים נתמך על ידי חלבון נתון מוטציה BRCA1.

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
<li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li>
<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
<li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li>
<li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li>
<li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li>
<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

היתרון של שיטה זו הוא כי אנו יכולים לחקור את הפונקציה של החלבון BRCA1 בוויסות תיקון DNA על ידי רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים בעלי wild-type BRCA1 הביע endogenously. אימצנו שתי שיטות הוקמה נפרדים של הלומדים בתהליך הומולוגיים רקומבינציה של ניצול RNAi בתיווך דלדול כדי להשיג את שיטה חדשה לבדיקת גרסאות BRCA1 עבור לתפקד תיקון דנ&quot;א. המפתח להצלחה של שיטה זו היה להקים קו תא transfectable בקלות, כמו הלה, עם המצע רקומבינציה בגנום כך אנו מקבלים רמות גבוהות מאוד של ההמרה GFP. היו לנו מספר הוקרן שיבוטים של טרנספורמציה המקורי כדי להשיג אחד כי לא היה אות לגילוי GFP ברקע, אבל על transfection הביטוי I-SCEI הפלסמיד לו רמה גבוהה מאוד של ההמרה GFP. באמצעות שיטה זו, אנו נמצאים כעת בחקירת אחרים ספציפיים חומצה אמינית BRCA1 שאריות עבור לתפקד רקומבינציה הומולוגיים. יחד עם תובנות ביולוגיות מעבודה זו, מסקנות אלה יכול להיות מיושם על גנטיקה וסרטן קליניים. אחוז גבוה של מוטציות BRCA1 missense יש משמעות קלינית ידוע מאז ישנם וריאנטים נדירים רבים, ואין מספיק מידע עבור רבים של אלה לקבוע את הקשר סרטן על ידי ניתוח הפרדה גנטית 3,10,13,14. באמצעות שיטה זו, התוצאות של גרסה מסוימת על התפקוד הביולוגי של BRCA1 בוויסות הומולוגיים רקומבינציה יכול לשמש כדי ליידע את הנשים לבצע אחת הגרסאות הללו בגנום שלהם.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>לא רלוונטי</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>פיורומיצין</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>סודיום פירובט</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי השפעות של מוטציות brca1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס brca1 אנדוגני wild-type

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

ניתוח פונקציונלי של מוטציות missense יכול להיות מסובך ידי נוכחות בתא של חלבון אנדוגני. מבנה פונקציה ניתוח BRCA1 כבר מסובך מחוסר assay חזקים החלבון BRCA1 מלא אורך הקשיים הכרוכים בעבודה עם שורות תאים המבטאים חלבון BRCA1 hypomorphic 1,2,3,4,5. פיתחנו מערכת לפיה את החלבון BRCA1 אנדוגני בתא היה מדולדל בחריפות על ידי RNAi מיקוד 3&#39;-UTR-mRNA BRCA1 ו הוחלף על ידי שיתוף transfecting פלסמיד המבטא גרסה BRCA1. אחד היתרונות של הליך זה היא כי ההשתקה חריפה של החלפת BRCA1 ו סימולטני לאפשר לתאים לגדול ללא מוטציות משני או התאמות שעלולות להתעורר לאורך זמן על מנת לפצות על אובדן של הפונקציה BRCA1. דלדול זה ולהוסיף גב ההליך נעשה קו הלה הנגזרות תא היה assayed בקלות לפעילות הומולוגיים רקומבינציה. Assay הומולוגיים רקומבינציה מבוסס על שיטה שפורסמו בעבר לפיה מצע רקומבינציה משולב לתוך הגנום (איור 1) 6,7,8,9. זה המצע רקומבינציה יש נדיר חיתוך I-SCEI אנזים הגבלה בתוך אתר אלל GFP פעיל, במורד הוא אלל second-GFP פעיל. Transfection של פלסמיד המבטא I-SCEI תוצאות לשבור פעמיים תקועים, אשר עשוי להיות מתוקן על ידי רקומבינציה הומולוגיים, ואם הומולוגיים רקומבינציה עושה לתקן את לשבור אותו יוצר אלל GFP פעיל כי הוא הבקיע בקלות ביטוי חלבון ה-GFP על ידי זרימת cytometry . דלדול של BRCA1 אנדוגני הביא לירידה של 8-10 פי בפעילות הומולוגיים רקומבינציה, ולהוסיף גב של הפונקציה רקומבינציה פלסמיד wild-type שוחזר במלואו הומולוגיים. כאשר נקודה מסוימת של מוטציות BRCA1 באורך מלא באו לידי ביטוי מתוך שיתוף transfected פלסמידים, ההשפעה של מוטציה missense ספציפי יכול להיות קלע. כדוגמה, את הביטוי של החלבון BRCA1 (M18T), סוג של משמעות קלינית ידוע 10, באה לידי ביטוי התאים האלה, היא לא הצליחה לשחזר BRCA1 תלויי הומולוגיים רקומבינציה. על ידי הביטוי לעומת זאת, גרסה של אחר, גם משמעות ידועה, BRCA1 (I21V) שוחזר במלואו BRCA1 תלויי הומולוגיים פונקציה רקומבינציה. אסטרטגיה זו של בדיקות תפקוד של מוטציות BRCA1 missense הוחל על מערכת ביולוגית אחרת assaying לתפקוד centrosome (קייס ואח&#39;, תצפיות לא פורסם). ככלל, גישה זו מתאימה לניתוח מוטציות בגן missense כל זה יש לנתח recessively.

אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ&quot;א על ​​ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

הניתוח התפקודי של מוטציות מסוג missense עלול להסתבך בשל נוכחותו של החלבון האנדוגני בתא. ניתוחים של קשר המבנה-תפקוד של ה...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון וריאנטים ספציפיים בחלבון BRCA1 באמצעות בדיקת רקומבינציה הומולוגית in vitro. דבר זה מושג על ידי החלפת חלבון ה-BRCA1 מסוג הבר (wild type) האנדוגני בווריאנט הנבדק, באמצעות טרנספקציה של RNA מפריע קצר (siRNA) הספציפי ל-BRCA1 ושל פלסמיד לביטוי מחדש של חלבון וריאנט ה-BRCA1 הנבדק בתאים; כשלב שני, ה-siRNA והפלסמיד לביטוי BRCA1 מוטנטי מוחדרים יחד עם פלסמיד לביטוי של חלבון ICN1, הגורם לנזק ל-DNA באתר ספציפי בגנום ה-DNA של התא הנבדק. לאחר מכן, התאים מדגרים למשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר לנזק ולתיקון ה-DNA להתרחש; התוצאות המתקבלות מראות האם וריאנטים ספציפיים של חלבון ה-BRCA1 מתפקדים בתיקון DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית, בהתבסס על ניתוח פלואו-ציטומטריה של תאים המבטאים GFP.טכניקה זו משלבת שתי שיטות מבוססות במטרה ליצור מערכת ורסטילית לניתוח וריאנטים ספציפיים של חלבונים בתיקון נזקי DNA באמצעות רקומינציה הומולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא ששיטות שבוססו בעבר הסתמכו על שורות תאים עם נוקאאוט גנטי של BRCA1. אנו משתמשים בשורת תאים ניתנת לניהול בקלות יותר, הנגזרת מתאי HELOC, המאפשרת דלטור של BRCA1 באמצעות אינטרפרנציה של RNA של החלבון האנדוגני והחזרה של חלבון בדיקה לתאים אלו.כעת, כאשר אנו מבטאים גרסה מוטגנית של חלבון BRC1, נוכל לבחון רקומבינציה הומולוגית. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה בשל מוות תאי מסיבי במהלך הפרוצדורה. חשוב לקבוע בקפידה את תנאי החיתוך (transection) כדי למקסם את השפעת תגובת הרקומבינציה תוך הגבלת הציטוטוקסיות.לפני תחילת פרוטוקול זה, הוקם קו התאים hela DR 13 על ידי טרנספקציה של תאי hela עם P-D-R-G-F-P. יש לתחזק את קו התאים בצלחות פטרי של 10 סנטימטר במצע המכיל pur mycin לצורך סלקציה של תאים שעברו טרנספקציה יציבה. תת-המצע לשחלוף בפלסמיד P-D-R-G-F-P ובטרנספורמנטים היציבים מכיל שני אללים לא פעילים של GFP. אלל אחד אינו פעיל עקב הכללת אתר זיהוי של 18 זוגות בסיסים עבור אנזים ההגבלה ISCE one.ברצף הקידוד שלו, ביטוי של ISCE one בתאים אלו יוצר שבירה של DNA רב-גדילית או DSB באלל השני של GFP שאינו פעיל. החלק ברצף שלו המתואם עם אתר I SCE E one באלל הראשון הוא מסוג בר (wild type). אלל GFP שני זה יכול לתפקד כתור רצף עבור תיקון של DSB באמצעות רקומבינציה הומולוגית, מה שיוביל לאלל GFP פעיל, אשר ניתן לזיהוי בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה ביום שלפני הטרנספקציה הראשונה.השג צלחת של 10 סנטימטר המכילה תאי HeLa DR13 הנמצאים ברמת התלכדות (confluency) של 90% לפחות. בצע trypsinization לתאים ב-1 מיליליטר למשך שתי עד שלוש דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 9 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S וערבב היטב את תגסוס התאים באמצעות פיפטינג. הוסף 40 מיקרוליטר של תאים שעברו trypsinization לכל באער בצלחת של 24 באערים ב-0.5 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S. הדגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני למשך הלילה.ביום הראשון, התאים צריכים להגיע לרמת התמזגות (confluence) של בין 40% ל-50%. התחילו את התעתוק (transfection) על ידי ערבוב של ה-irna להדליית b RCA one אנדוגני והפלסמיד המבטא את המוטנט B RCA one בתוך מצע optimum.בצע את הטרנספקציה באמצעות ליפקטומין בהתאם להוראות היצרן לאחר הטרנספקציה. החזר את התאים לדגירה. החלף את המצע ארבע עד שש שעות מאוחר יותר במצע שאינו מכיל אנטיביוטיקה.החזירו את התאים לדגירה למשך לילה ביום השני. כדי לנתק את התאים, הוסיפו 0.3 milliliters של ריאגנט trip le trypsin לכל באר. לאחר דגירה קצרה ב-37 degrees Celsius, שחררו את התאיים באמצעות פיפוט של התאים למעלה ולמטה בתוך ריאגנט ה-trypsin. ברגע שה-trypsin פעל, העבירו את התאים מלוח ה-24 באר ללוח של 6 באר המכיל two milliliters של D-M-E-M-F-B-S כדי להפסיק את פעילות ה-trypsin.הדגרינו את פלטת שש הבארות למשך לילה תחת אותם תנאים כפי שבוצע לפני יומיים מהטרנספקציה הראשונית. הכיני את ה-SIR A, את ה-DNA הפלסמי המבטא את המוטציה BRCA1 ואת הפלסמיד המבטא את ISCE1 ב-62.5 µl של Optum. ערבבי תמיסה זו עם 2.5 µl של LIPECTOMY 2060 ו-2.5 µl של Optum.יש לבצע טרנספקציה לתאים לאחר דגירה של ארבע עד שש שעות. החליפו את המצע ב-D-M-E-M-F-P-S ללא אנטיביוטיקה. החזירו את התאים לאינקובטור ביום השישי.יש לעבד את התאים בכל באר באמצעות הוספת 0.5 milliliters של ריאגנט טריפסין. יש לעצור את התגובה על ידי הוספת שני milliliters של D-M-E-M-F-B-S, ולאסוף את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשעות את התאים במיליליטר אחד של D-M-E-M-F-B-S טרי, ולנתח 10,000 תאים לבאר לצורך בדיקת ביטוי GFP.באמצעות ציטומטריית זרימה, תאים חיים בודדים מופרדים (gated) באמצעות פרמטרי פיזור קדימה וגודל. תאים חיוביים ל-GFP מבודלים באמצעות גלאי הפלורסצנציה של GFP והתוצאות מוצגות כהיסטוגרמה. ניתן לזרוע מחדש את התאים הנותרים לצורך צילום פלורסצנטי.מיקרוסקופיה של BRCA1 הרצוי מווסתת את המסלול לתיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. תאים שעברו תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תשיג של BRCA1 באמצעות RNAi גורם לירידה חדה במספר התאים החיוביים ל-GFP שזוהו.הפלט מה-FCA הוא היסטוגרמה שבה עוצמת ה-GFP לכל תא מופיעה בציר ה-x ומספר התאים מופיע בציר ה-Y. בהיעדר טרנספקציה של פלסמיד ביטוי אחד ב-SCE, לא מזוהים תאים חיוביים ל-GFP.התוצאות בעמודות שתיים עד שש נלקחו כולן מתאים שבהם בוצע טרנספקציה של פלסמיד המבטא I SCE 1 ביום השלישי. בסט טיפוסי של תוצאות מניסוי בודד, 15.5% מהתאים הם חיוביים ל-GFP לאחר ביטוי של I SCE 1 ודילול RNAi של ביקורת עבור גן לא רלוונטי; לשם השוואה, דילול של BRCA1 והוספה של וקטור פלסמיד ריק הפחיתו את המרת ה-GFP ל-0.7%. הוספה של BRCA1 מסוג wildtype חיצוני שיקמה באופן מלא את הרקומבינציה ההומולוגית, כפי שזוהה על ידי קבלת 15% עד 16% תאים חיוביים ל-GFP.באופן דומה, ביטוי של וריאנט אחר בעל משמעות לא ידועה. מוטציית ה-BRCA one I 21 B שיחזרה באופן מלא את תפקוד הרקומבינציה ההומולוגית התלוי ב-BRCA one. להחזרה של המוטנט BRCA one M 18 T הייתה השפעה דומה לזו של ביקרת הווקטור.מכיוון שוריאנט זה התבטא ברמות דומות לחלבון האנדוגני, הדבר מרמז כי הוריאנט BRCA one M 18 T אינו תפקודי ברקומבינציה הומולוגית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעקוב אחר גדילת התאים; התאים גדלים לאט ובצפיפות (confluency) נמוכה, ולכן יש להפחית את כמות תערובת הטרנספקציה שבה משתמשים. כמו כן, חשוב להסיר את מצע הטרנספקציה במועד.מצאנו כי בימים שלאחר הטרנספקציה, קיימת רמה גבוהה של ציטוטוקסיות אם המצע כולל אנטיביוטיקה. מסיבה זו, כל המצעים לאחר היום הראשון אינם מכילים אנטיביוטיקה לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר סרטן השד לחקור את הגנטיקה של וריאנטים של BRC 1 בעלי משמעות קלינית לא ידועה במרפאות אונקולוגיות.אנו מקווים כי בדיקת ה-BRC one הפונקציונלית שפותחה בעבודה זו תאפשר חיזוי משופר של השפעותיהם של וריאנטים ב-BRC one על הנטייה לסרטן.

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

השתקת גנים על ידי siRNA מייצגת אסטרטגיה ניסויית נוחה לניתוח פונקציות ביולוגיות תלויות BRCA2 עם השלכות מיידיות להבנה טובה יותר של הביולוגיה של הסרטן. מוצגת שיטה להשתקה יעילה של BRCA2, יחד עם ההליך הניסיוני לאיתור וכימות שינויים בביטוי חלבון BRCA2 על ידי אימונובלוטינג בשורות תאים אנושיים.

השתקת<em&gt; BRCA2</em&gt; לזיהוי פונקציות ביולוגיות-מוסדר BRCA2 רומן בתאי אדם בתרבית

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

אנשים עם מוטציות BRCA1 יש סיכון גבוה יותר לפתח סרטן, אשר מצדיק הערכה מדויקת של הפונקציה של גרסאות BRCA1. בזאת, תיארנו פרוטוקול להערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס ציטוצין בתיווך CRISPR המאפשרים המרת C:G ממוקדת ל- T:A בתאים חיים.

הערכה פונקציונלית של גרסאות BRCA1 באמצעות עורכי בסיס בתיווך CRISPR

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

פרוטוקול זה מתאר בדיקת הצטרפות קצה חוץ-כרומוזומלית לא הומולוגית (NHEJ) ובדיקת רקומבינציה הומולוגית (HR) כדי לכמת את היעילות של NHEJ ו- HR בתאי HEK-293T.

ניתוח של חיבור קצה לא הומולוגי ויעילות רקומבינציה הומולוגית בתאי HEK-293T באמצעות מערכות דיווח מבוססות GFP

פרוטוקול זה נועד לחקור את מידת הנזק לדנ"א המתרחש במהלך שכפול DNA. בתנאים ניטרליים, ניתן להעריך בקלות את השראת הפסקות הדנ"א תוך פרק זמן קצר. בנוסף, הפרוטוקול ניתן להתאמה לסוגי תאים אחרים ולריאגנטים שונים של עקת שכפול.

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

למדו לבדוק וריאנטים של BRCA1 ברקומבינציה הומולוגית באמצעות RNAi וזרימה ציטומטרית בתאי HeLa. שיטה זו מאפשרת הערכת תפקוד DNA תיקון במחקר סרטן השד.

זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type

גלה סרטונים נוספים