ניתוח של דיכוי תמלול של תא מאכסן המושרה על ידי נגיף באמצעות ציטומטריה עם זרימה

קח תרביתי תאי יונקים. הדבק את תרבית הניסוי בנגיף, והשאר את תרבית הביקורת ללא הדבקה.

אפשרו את ספיגת הנגיף, ולאחר מכן החליפו את המצע.

הנגיף חודר לתא ומשחרר את הגנום שלו. הנגיף מבטא חלבון virulent שדסטביליז את קומפלקס גורמי השעתוק של המארח ומדכא את השעתוק של המארח.

תאי הביקורת, לעומת זאת, שומרים על תעתוק פעיל.

הוסיפו אנלוג של נוקליאוסיד המשלב את עצמו בתוך RNA נסותי.

אספו את התאים השטופים.

קבעו את התאים כדי לשמר את מבנם. סובבו את התאים בצנטריפוגה ושטפו אותם עם בופר.

הוסיפו דטרגנט כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization), ולאחר מכן שטפו.

הוסיפו צבע פלואורסצנטי שעבר שינוי כימי ומגיב עם האנלוג של הנוקלאוזיד כדי לסמן RNA גדיל (nascent RNA); לאחר מכן שטפו.

בצעו צביעה אימונופלואורסצנטית לסמן אנטיגנים ויראליים, לצורך זיהוי התאים המזוהמים.

השתמשו בציטומטריה של זרימה כדי לזהות פלואורסצנציה של RNA של המארח ושל אנטיגן ויראלי.

השוו את עוצמת הפלואורסצנציה של ה-RNA בין קבוצת הביקורת לקבוצת הבדיקה. הסטה כלפי מטה באוכלוסיית הבדיקה, המעידה על ירידה בפלואורסצנציית ה-RNA, מרמזת על דיכוי תעתוק המושרה על ידי הנגיף.

בהתאם לתכנון הניסוי, הדביקו את תאי ה-293 ב-MP-12 ב-MOI של שלוש. הסירו את מצע הגידול והוסיפו תמיסת נגיף מדוללת, והדגירו למשך שעה אחת באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. ה