הפקה של נגיף סינציטיאלי נשימתי (RSV) רקומביננטי המסומן ב-GFP באמצעות מערכת ביטוי T7

התחל עם תערובת פלסמידים המכילה פלסמידי עזר המקודדים לחלבוני השכפול והשעתוק של RSV ופלסמיד נפרד הנושא cDNA של אנטי-גנום RSV באורך מלא המבטא GFP.

כל פלסמיד נמצא תחת בקרה של פרומוטור T7.

הוסף ריאגנט טרנספקציה מבוסס ליפוזומים והדגר כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים.

החדירו קומפלקסים אלו לתאי כליה של המסטר המהונדסים גנטית המבטאים T7 RNA polymerase והדגירו.

קומפלקסי הפלסמיד חודרים לתאים, שם T7 RNA polymerase מתעתקת את פלסמידי ה-RSV.

תהליך זה מייצר mRNA ויראלי המקודד לחלבוני שכפול ותעתוק, ומייצר RNA אנטיגנומי של RSV בעל רצף חיובי.

באמצעות מנגנוני המארח, mRNA אלו מייצרים חלבונים לשכפול ולשעתוק ויראליים המרכיבים קומפלקס פולימרז תפקודי של RSV.

קומפלקס הפולימראז של ה-RSV ממיר לאחר מכן את ה-RNA בעל הרצף החיובי ל-RNA גנומי ויראלי.

RNA גנומי זה מכוון את הסינתזה של mRNAs ויראליים, המקודדים לחלבונים מבניים ול-GFP.

תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, פלואורסצנציה ירוקה מאשרת את ביטוי הגן הוויראלי ואת תחילת ייצור ה-RSV הרקומביננטי.

יום לפני הטרנספקציה, השהו תאי BSR-T7/5 במצע מלא בריכוז של 0.5 מיליון תאים למיליליטר. חלקו שני מיליליטרים של תרחיף התאים לכל באר בלוח שש בארות. דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני עד להגעה ל-80-90% התמזגות (confluency) למחרת. כדי להציל כל נגיף, ערבבו תחילה מבחנה של וקטו