הערכת קיבולת שכפול נגיפי באמצעות בדיקת טרנסקריפטאזה הפוכה מסומנת רדיואקטיבית

קחו על-נוזלי תרבית המכילים ויריונים של דור הבנים ששוחררו מתאי מאכס שהודבקו עם וריאנט של HIV-1 לבדיקה או עם ביקורת מסוג wild-type.

הנגיף הנבדק נושא וריאנט גנטי המשנה את יעילות השכפול ומשפיע על ייצור של ויריונים צאצאים.

הוסיפו את העל-נוזלים (supernatants) לתערובת של תעתוק הפוך המכילה נוקלאוטיד מסומן רדיואקטיבית, נוקלאוטיד שאינו מסומן, תבנית RNA, פריימר, קו-פקטורים, דטרגנט ומייצבים.

דגרו כדי לאפשר היווצרות של קומפלקס תבנית-פריימר בעוד הדטרגנט ממיס את הוויריונים ומשחרר את ה-reverse transcriptase, או RT.

RT מסנתז DNA מקומפלקס התבנית-פריימר, תוך שילוב הנוקליאוטיד המסומן רדיואקטיבית.

העבירו את הדגימות לממברנה הקושרת חומצות גרעין ויבשו באוויר כדי לקבע את ה-DNA המסומן רדיואקטיבית.

שטפו שוב ושוב עם באפר ואתנול תחת ערבוב כדי להסיר רכיבים שאינם קשורים.

ייבשו את הממברנה באוויר ועטפו אותה. חשפו אותה למסך רגיש לקרינה וזהו אותות באמצעות phosphorimager.

אות מופחת במבחן מעיד על רמות RT נמוכות יותר, המשקפות ירידה בייצור הוויריונים בהשוואה לבקרה.

בנוהל זה, יש להוסיף 1-2 µl של 10 mCi/ml של dTTP ו-4 µl של 1 M dithiothreitol לכל מנה של 1 ml של תערובת מאסטר ל-RT. ערבבו בזהירות כל מבחנה של 1.5 ml של תערובת מאסטר ל-RT, DTT ו-dTTP באמצעות פ pipette של 1,000 µl והעבירו לאמבטיה סטרילית.

לאחר מכן, העבירו 25 µl של תערובת