הכנת דגימות לכימות נגיפי מבוסס לוסיפראז

התחילו עם פלטת ריבוי בארות המכילה תאי אפיתל שהודבקו בנגיף שעבר שינוי גנטי.

הנגיף נושא טרנסגן המקודד לאנזים לוסיפרז.

קחו תרביות טריות של תאי אפיתל בלוח רב-בארים בעל דפנות לבנות.

העבירו את העלייה המכילה ריכוזים לא ידועים של נגיף אל הבארות בעלות הדפנות הלבנות.

במקביל, הוסיפו ריכוזים ידועים של הנגיף כסטנדרטים.

סבבו את הפלטה בצנטריפוגה כדי לעודד מגע הדוק בין החלקיקים הוויראליים לבין קולטני פני השטח של תא המאחסן, והדגרירו.

הנגיף חודר לתא המארח ומעביר את גנום ה-RNA בעל הגדיל השלילי שלו.

לאחר מכן, ה-RNA polymerase הויראלי מתמלל את הגנום ל-mRNA.

באמצעות המכניקה התאית של המארח, ה-mRNA מתורגם לחלבונים ויראליים, כולל לוציפראז.

כמות הלוציפראז שהצטברה בתוך תא המאכסן עולה עם עליית הריכוז הוויראלי.

הדגימות מוכנות להערכה נוספת של ריכוזי הנגיף באמצעות בדיקת לוסיפראז.

הכינו עקומת סטנדרט של VSV-Delta-51 ב-DMEM ללא סרום כך שהריכוז הסופי של יחידות יוצרות פלאק (plaque forming units) למיליליטר לאחר ההעברה לתאי Vero יהיה כדלקמן. הכינו 50 µl מכל ריכוז לכל פלטה של תאי Vero, בתוספת 10% רזרבה. ניתן להעביר את עקומת הסטנדרט לפלטת 96 בארות עמוקות (deep well plate). לאחר מכן, בדקו את תאי ה-Vero שנזרעו בפלטת 96 בארות בעלת תחתית שקופה תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהשכבות התאיות (monolayers) הגיעו ללפחות 95% התלכדות (confluent).