זיהוי תאים המודבקים בווירוס ואקסיניה רקומביננטי באמצעות סלקציה מטבוליטית ופלואורסצנטית

התחל עם תאי אפיתל שהודבקו בנגיף הווקסיניה (vaccinia virus) והועברו להם (transfection) וקטור פלסמיד לרקומבינציה.

הווקטור נושא גן מטרה המסומן בفلורסצנציה ירוקה וגן ברירה מטבולי המסומן בفلורסצנציה אדומה תחת מקדם ויראלי.

במהלך השכפול של ה-DNA הנגיפי, קסטת הפלסמיד מוכנסת לתוך הגנום הנגיפי.

אסוף את התאים במדיום ללא סרום.

השתמש במחזורי הקפאה-הפשרה כדי ללווס את התאים ולשחרר את הנגיפים.

הכינו דילולים סדרתיים של הליזט.

הדביקו תאי אפיתל טריים באמצעות הליזאט המדלל כדי לקבל פלאקים בודדים ומופרדים.

הוסף מצע המכיל סרום להישרדות התאים וסוכן ברירה מטבולי, ולאחר מכן דגור.

סוכן הברירה מעכב אנזימים המעורבים בסינתזת נוקלאוטידים. רק תאים נגועים הנושאים את הגן לברירה מטבולית מבטאים אנזים חלופי המאפשר סינתזה של נוקלאוטידים, ובכך מאפשר את הישרדותם.

הסר את המדיום ובחן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.

נוכחות של פלואורסצנציה אדומה וירוקה גם יחד בתוך פלאק מעידה על שילוב מוצלח של הקסטה וביטוי של הגן המטרה.

הדביקו שכבה אחת (monolayer) של תאי BS-C-one בנגיף הוואקסיניה (vaccinia virus) במצע ללא סרום.

שעה אחת לאחר ההדבקה, יש להציל את התאים באמצעות DMEM (Dulbecco's modified eagle medium). יש לבצע טרנספקציה עם תערובת של פלסמיד וקטור רקומבינציה וחומרי טרנספקציה ביחס של 3:1 במדיום ללא סרום. לאחר 24 שעות, יש לגרד ולאסוף את התאים ב-DMEM