אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:55 דק׳ • September 30th, 2026
קחו תרבית של תאי סרטן אנושיים המבטאים חלבון מטרה אנדוגני והסִירו את המצע.
קחו תרחיף של אדנווירוס רקומביננטי הנושא גן המקודד לחלבון המטרה המסומן בפלואורופור.
הוסיפו נפח קטן של תרחיף הנגיף אל התאים כדי להבטיח מגע הדוק בין הנגיף לבין פני השטח של התא.
דגרו תוך כדי ניעור מדי פעם כדי לאפשר היצמדות של הווירוסים.
הוסף מצע גידול נוסף לתרבית.
בשלב הבא, הכניסו קומפלקס של siRNA–calcium phosphate כדי להכווין את התקיפה אל ה-mRNA של חלבון המטרה האנדוגני, והדגירו.
סידן הפוספט משפר את ספיגת ה-siRNA, וה-siRNA נטען לתוך RISC.
קומפלקס ה-siRNA–RISC נקשר לאחר מכן ל-mRNA המטרה ומבצע בו שסוע, ובכך מעכב את ביטוי החלבון.
במקביל, האדנווירוס חודר לתא ומשחרר את ה-DNA שלו, המכוון את הביטוי של חלבון המטרה המסומן בפלואורופור.
דבר זה מאפשר דילול של חלבון המטרה האנדוגני והחלפתו בו-זמנית בחלבון המסומן בפלואורופור.
שטפו את התאים עם בופר ובצעו דימוי פלואורסצנציה כדי לנתח את חלבון המטרה.
סמנו מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר לכל תנאי, והוסיפו 400 מיקרוליטר של alpha MEM minus חמים. לאחר הפשרה איטית של מנות הווירוסים על קרח, הוסיפו לנבחנות את הנפח הנדרש מכל וירוס וערבבו בעדינות באמצעות פיפטה. לאחר מכן, לאחר שאיבת המצע מהתאים, הוסיפו בעדינות את תערובת הווירוסים בטיפות. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים