סימון של שאריות ציסטאין נגישות לפני השטח בחלקיקים דמויי נגיף מהונדסים

התחילו עם תרחיפים של חלקיקים דמויי נגיף (VLPs) מוטסים שנוקו מעלי טבק נגועים.

ה-VLPs המוטנטיים מכילים שאריות ציסטאין שהוכנסו גנטית במיקומים ספציפיים בחלבון המעטפת הוויראלי.

הוסף צבע פלואורסצנטי מצומד למאליימיד, והדגר את התערובת בחושך.

המאלימיד נקשר רק לשארי כוסטאין החשופים על פני השטח של ה-VLP, בעוד שכוסטאינים הטמונים בתוך מבנה החלבון נותרים בלתי נגישים ואינם מסומנים.

הוסף חומר מחזר כדי לחסום כל צבע שלא הגיב ולמנוע סימון לא ספציפי.

העמיסו את הדגימות לתוך עמודי הסמכה (desalting columns) הממולאים בשרף נקבובי, ולאחר מכן סבבבו בצנטריפוגה כדי לטהר את ה-VLPs המסומנים.

צבעים וחומרי חימצון שלא הגיבו מפעפעים לתוך חרוזי שרף נקבוביים ונשארים בהם, בעוד ש-VLPs הגדולים יותר נדחים מהנקבים ונשטפים ראשונים.

ניתן כעת לנתח את ה-VLPs המסומנים פלואורסצנטית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.

פסים פלואורסצנטיים על הג'ל מראים מוטנטים מסומנים עם שאריות ציסטאין חשופות על פני השטח.

לאחר הפקת תמלילי T7-RNA עם כיסוי (Capped) מפלסמיד וקטור המבוססים על Potato virus X הנושאים את הגנים של חלבון המעטפת של MRFV מסוג הבר (wild type) ושל חלבון מעטפת עם מוטציה בציסטאין (cys-mutated), השתמשו בשתי מנות של 10 µL כל אחת כדי להחדיר אותן לשני עלים של N. benthamiana. דגרו את הצמחים למשך 10 ימים בחממה בלחות של 60%, עם 16 שעות של אור בטמפרטורה