פונקציונליזציה פלואורסצנטית של חלקיקים דמויי נגיף באמצעות בנייה מחדש של גשרי דיסולפיד

התחל עם חלקיקים דמויי נגיף, או VLPs, המכילים קשרי דיסולפיד החשופים על פני הקפסיד.

הוסיפו חומר מחזר כדי לנקטוע את קשרי הדיסולפיד, ובכך ליצור קבוצות תיול חופשיות תוך שמירה על מבנה הקפסייד.

שלב את ה-VLPs המחוזרים עם פוליאתילן גליקול המגיב עם תיול, או מקשר PEG, כדי למנוע חמצון חוזר של התיול.

מקשר ה-PEG מחבר מחדש כל זוג תיואולים על ידי יצירת שני קשרי קוולנטיים.

צימוד קוולנטי זה יוצר גם מבנה פלואורסצנטי הנראה בצהוב בהיר תחת הארה ב-UV.

סובב את התערובת למשך פרק זמן ממושך כדי לאפשר הצמדה מלאה.

באמצעות סינון צנטריפוגלי, טהרו את ה-VLPs שעברו פגילציה (PEGylated) על ידי הסרת מולקולות קטנות שלא הגיבו, תוך שימור התצמידים השלמים.

בצע SDS-PAGE שאינו מחזר כדי לזהות את הצמדת ה-PEG, המזוהה על ידי פס פלואורסצנטי של חלבון המעטפת.

העריכו את השלמות המבנית באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוזה במצב טבעי (native), כאשר פסים דומים עבור VLPs שעברו פגילציה (PEGylated) וכאלה שלא עברו פגילציה מאשרים את נוכחותם של VLPs שלמים.

פרוטוקול זה מניב VLPs פלואורסצנטיים המפונקציונליים ב-PEG, המתאימים ליישומי דימוי או למשלוח ממוקד.

סכימה זו מציגה את הצימוד שיודגם. 10 שווה ערך של Tris(2-carboxyethyl)phosphine או TCEP ביחס לגשרים הדיסולפידיים במיליגרם אחד של Q-Beta משמשים להחזרת כל הדיסולפידים כדי להפיק קפסיידים של Q-Beta מושחזרים בטמפרטו