טיהור פלסמיד דנ"א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

אני מהמעבדה של מייק היילן, מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה, ארווין. היום אראה לכם כיצד להשתמש בערכת collagen mini fabricate לניקוי DNA מחיידקים. אני מבצע זאת כשלב אחד בניסוי של מוטציה מכוונת (site directed mutagenesis).

לאחר קבלת הפלסמיד, אבצע ריצוף של המקטע המוחדר כדי לוודא שהקלונים שנבחרו מכילים את המוטציות הרצויות. לפני שנעבור להכנה קטנה (mini preparation), אסכם בקצרה את הפעולות שביצענו אתמול. כדי לגדל חיידקים, עליי להחדיר תחילה תכשיר לתוך מבחנות בודדות המכילות 5 mL של LB.

וכפי שניתן לראות, לפני הכנסת החיידקים למבחנה, המצע צלול. לאחר מכן, אני משתמש בפיפט כדי להחדיר מושבה בודדת מצעית אגר, ואני מחליף קצה פיפט בכל פעם כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, אני שם את המבחנות בשייקר במהירות של 300 RPM לגידול למשך שמונה שעות לפחות, ובדרך כלל ניתן לבצע זאת במהלך הלילה.

בערכה להכנה מזעורת של קולגן ישנם שלושה תמיסות חוצץ (buffers) חשובות: P one, P two ו-N three. בדרך כלל אנו שומרים את P one בטמפרטורה של 4°C מכיוון שהוא מכיל RNAs, את P two אנו משאירים בטמפרטורת החדר, ואת N three אנו נכין זמן קצר לפני הניסוי, לאחר שמונה שעות.

כפי שניתן לראות, המצע כעת עכור מכיוון שחיידקים גדלים בתוכו, ואני אעביר 5 µL מהמצע לצלחת אחרת. כך, ברגע שאאמת את השבטים, אוכל לחזור ישירות לחיידקים ולא אצטרך לבצע טרנספורמציה נוספת. לאחר סבב של המצע, ניתן לראות משקע חיידקים יפה בתחתית המבחנה, ואנו נשפוך את הנוזל העליון למלבין כדי למנוע זיהום של הסביבה, בעוד המשקע עדיין נמצא שם.

כעת אני מוסיף את בופר P1 אל פלטות החיידקים. P1 הוא בופר רסספנזיה (resuspension buffer) לשחרור החיידקים. כעת אעביר את התמיסה למעלה ולמטה באמצעות הפ pipette כדי לערבב את החיידקים עם הבופר.

בשלב זה, אין לרצות לראות עכירות של חיידקים בתמיסה. כעת אעביר את החיידקים שעברו ריסספנזיה לשפרובית Eppendorf חדשה. אני תמיד מסמן את השפרורות שלי כדי שאוכל להבדיל ביניהן ולדעת איזו תמיסה הגיעה מאיזה שיבוב.

כעת הוספתי את buffer P2 לכל מבחנה; buffer P2 הוא בופר ליזיס המשמש לליזיס של חיידקים. לאחר הוספת ה-buffer P2, ניתן לראות שהתמיסה עדיין אינה צלולה. כעת אני הופך את כל המבחנות מספר פעמים כדי שהתמיסה תעורבב היטב.

כעת ניתן לראות שהתמיסה הופכת לצלולה. כעת אני מוסיפה את באפר N3 לכל מבחנה; באפר N3 הוא באפר נטרול. ברגע שהוספתי את באפר N3, אני רואה מיד את שקיעת החלבון, אך אני עדיין אהפוך את המבחנות מספר פעמים כדי לערבב את התמיסה ביסודיות.

לאחר ערבוב יסודי של התמיסה. כך זה צריך להיראות לאחר שהוספתי את באפר 3. כעת אשתמש בצנטריפוגה כדי לשקע את השקע החלבוני; במהלך הסבוב למשך 10 דקות, הרכבתי Cal VAC 6 s.

חיברתי את כל החלקים לפי הסדר ולאחר מכן חיברתי אותם למערכת ואקום. כעת אני מוסיף את עזרת הכנת הכיול, את הרצועה למסעף. היום נבצע רק אחד, לכן אני חוסם את שאר החריצים.

כעת יש לנו ואקום טוב. כפי שניתן לראות, סימנתי את הרצועה בהתאם למבחנות שלי, וברגע שהפעלתי את השאיבה קיבלתי ואקום טוב. אוקיי, לאחר סבוב המבחנה, ניתן לראות את משקע החלבון בתחתית, וה-DNA אמור להישאר מומס בתא על.

כעת נעביר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל DNA, אל רצועות הניקיון של ה-cow prep. עלי לציין כי עלינו תמיד להחליף טיפים על מנת למנוע זיהום צולב. כעת אני מדליקה את הוואקום. כעת אני מכבה את הוואקום ומוסיפה בופר PB כדי לשטוף את הרצועה, שבשלב זה מכילה DNA במסנן.

כעת אני מוסיף את תמיסת PB לפס כדי לשטוף אותה, כאשר הפס עדיין מכיל DNA במסנן. הפעם איני צריך להחליף את הטיפים אם איני נוגע בפס. כעת אני מוסיף את באפר P לפס באותה הדרך שבה הוספתי את באפר PB.

אבצע זאת פעמיים לאחר הפעלת הוואקום. כפי שניתן לראות, תמיסת ה-P עוברת כעת דרך הרצועה, ונשאיר את הוואקום פועל למשך חמש דקות נוספות כדי להבטיח שהמסנן יהיה יבש מאוד. לאחר חמש דקות של ואקום, הוצא את הרצועה מהקופסה ועטוף אותה ב-Kim wipe. הכה בה בעדינות נגד השולחן כדי להסיר שאריות של באפר P.

כעת ניתן לראות שנותרה כמות קטנה של P buffer, וה-DNA אמור להישאר עדיין במסנן. אלו הן מיקרו-מבחנות האיסוף; סימנתי אותן בהתאם לפס.

כעת אני פותח את מכשיר השאיבה (vac) ומרכיב אותו מחדש עם מיקרו-מבחנות האיסוף, ומוודא שהרצועה תואמת למיקרו-מבחנות. כך אמור להיראות הסניפטור (manifold) כעת. להלן מבט על סניפטור השאיבה, שמוכן להשקייה (eluting) של DNA מהרצועה אל המיקרו-מבחנה.

הפס הנייר נמצא למעלה והמבחנה נמצאת מיד תחתיו, ומסומנות באופן זהה. כעת הוסיפו מים סטריליים לפס הנייר ללא ואקום והמתינו דקה. הפעם, כאשר הוואקום ממושך, כפי שניתן לראות, המים עוברים דרך פס הנייר ונכנסים לתוך מיקרו-מבחנות האיסוף.

המים מכילים את ה-DNA. אני משאיר את הוואקום פועל למשך זמן קצר כדי לוודא שכל המים ייאספו. להלן מיקרו-מבחנות האיסוף עם תמיסת ה-DNA לאחר השלב הזה.

שלום, הרגע הדגמתי בפניכם כיצד להשתמש בערכת calcium mini prep לטיהור DNA מחיידקים. כעת אני ארצף את המקטע המוכנס (insert) כדי לאמת את הכלונים הנכונים, ועלי לציין את השימוש בשיטה זו. כמות ה-DNA היא בדרך כלל בסדר גודל של מיקרוגרם.

ובהצלחה בניסוייכם. תודה שצפיתם.