Name: טיהור פלסמיד דנא מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למד כיצד לטהר DNA ממושבות חיידקים באמצעות ערכת Miniprep של Qiagen לצורך מוטגנזה מכוונת אתרים. שיטה זו מאפשרת הכנת פלסמידים לריצוף ואימות מוטציות בקלות וביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות miniprep qiagen kit

Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מן החיידק היא טכניקה הליבה של שיבוט מולקולרי. טיהור בקנה מידה קטן (miniprep) מתוך פחות מ 5 מ&quot;ל של תרבית החיידקים הוא דרך מהירה לצורך אימות לשבט או בידוד ה-DNA, ואחריו עוד תגובות אנזימטיות (שרשרת פולימראז התגובה אנזים העיכול הגבלה). הנה, אנחנו וידאו מוקלט הנהלים הכללי של miniprep באמצעות ערכת QIAprep של QIAGEN Miniprep 8, במטרה להציג את הטכניקה היעילה ביותר על כללי למתחילים טכניקות הביולוגיה המולקולרית. ההליך כולו מבוסס על תמוגה אלקליין של תאים E. coli ואחריו ספיחה של ה-DNA על סיליקה בנוכחות מלח גבוהה. הוא מורכב משלושה שלבים: 1) הכנה וניקוי של lysate חיידקי, 2) ספיחה של ה-DNA על הממברנה QIAprep, 3) כביסה elution של DNA פלסמיד. כל הצעדים נעשים ללא שימוש פנול, כלורופורם, CsCl, ברומיד ethidium, ללא משקעים אלכוהול. בדרך כלל לוקח פחות מ 2 שעות כדי לסיים את ההליך כולו.

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

טיהור DNA פלסמידי מ-E. coli הוא טכניקה מרכזית לשבוט מולקולרי. טיהור בקנה מידה קטן (miniprep) מפחות מ-5 מ"ל של תרבית חיידקים...

אני מהמעבדה של מייק היילן, מהמחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה באוניברסיטת קליפורניה, ארווין. היום אראה לכם כיצד להשתמש בערכת collagen mini fabricate לניקוי DNA מחיידקים. אני מבצע זאת כשלב אחד בניסוי של מוטציה מכוונת (site directed mutagenesis).לאחר קבלת הפלסמיד, אבצע ריצוף של המקטע המוחדר כדי לוודא שהקלונים שנבחרו מכילים את המוטציות הרצויות. לפני שנעבור להכנה קטנה (mini preparation), אסכם בקצרה את הפעולות שביצענו אתמול. כדי לגדל חיידקים, עליי להחדיר תחילה תכשיר לתוך מבחנות בודדות המכילות 5 mL של LB.וכפי שניתן לראות, לפני הכנסת החיידקים למבחנה, המצע צלול. לאחר מכן, אני משתמש בפיפט כדי להחדיר מושבה בודדת מצעית אגר, ואני מחליף קצה פיפט בכל פעם כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, אני שם את המבחנות בשייקר במהירות של 300 RPM לגידול למשך שמונה שעות לפחות, ובדרך כלל ניתן לבצע זאת במהלך הלילה.בערכה להכנה מזעורת של קולגן ישנם שלושה תמיסות חוצץ (buffers) חשובות: P one, P two ו-N three. בדרך כלל אנו שומרים את P one בטמפרטורה של 4°C מכיוון שהוא מכיל RNAs, את P two אנו משאירים בטמפרטורת החדר, ואת N three אנו נכין זמן קצר לפני הניסוי, לאחר שמונה שעות.כפי שניתן לראות, המצע כעת עכור מכיוון שחיידקים גדלים בתוכו, ואני אעביר 5 µL מהמצע לצלחת אחרת. כך, ברגע שאאמת את השבטים, אוכל לחזור ישירות לחיידקים ולא אצטרך לבצע

purifying-plasmid-dna-from-bacterial-colonies-using-qiagen-miniprep

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה הוא חלופה חסכונית הבהרה במקביל יעילה לטיהור פלסמיד דנ"א...

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

פותחה שיטת מיצוי DNA היברידית אוטומטית למחצה לשימוש עם דגימות ייצור עופות סביבתיות והדגימה שיפורים על פני שיטת מיצוי מכנית ואנזימטית נפוצה מבחינת ההערכות הכמותיות והאיכותיות של כלל קהילות החיידקים.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

המיני-וקטור של ה-DNA הסגור קוולנטית ליניארית (LCC) הוא וקטור העברת גנים לא ויראלי המציע יעילות טרנספקציה גבוהה ורלוונטי לכל יישום העברת DNA. מערכת הייצור פשוטה, מהירה וניתנת להרחבה in vivo. הפרוטוקול הבא מספק הוראות חזותיות שלב אחר שלב לייצור מיני-מחרוזות DNA.

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

כאן, אנו מציגים כימרה הרכבה על ידי התאוששות פלסמיד והגבלת אנזים האתר הכניסה (CAPRRESI), פרוטוקול המבוסס על החדרת אתרי אנזים הגבלה לתוך רצפי DNA נרדף התאוששות פלסמיד פונקציונלי. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה בעלות נמוכה עבור מיזוג גנים מקודדים חלבונים.

CAPRRESI: כימרה האסיפה על ידי פלסמיד השחזור והגבלת אנזים האתר הכנס

פרוטוקול זה מתאר את העברת הפלסטיות הגבוהה ביותר של תאי היונקים בצלחת 384-היטב באמצעות טכנולוגיית הפליטה האקוסטית של ה-droplet. הזמן גוזלת, שגיאות-DNA לחילוק ו ריבוב, אבל גם התרגום המקביל מגיב, הם תוכנה מונחה ומבוצעת על ידי מכשיר ננו. התאים הם הנזרע לאחר מכן בארות מלאות אלה.

התפוקה הגבוהה של DNA פלאגיסינג ומעבר באמצעות טכנולוגיית ננו-לחילוק אקוסטית

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.

שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016

וירוס רקומביננטי הקשור באדנו (rAAV) נמצא בשימוש נרחב להעברת גנים קליניים ופרה-קליניים. שימוש לא מוערך מספיק עבור rAAVs הוא התמרה חזקה של תאים בתרבית ללא צורך בטיהור. עבור חוקרים חדשים ב-rAAV, אנו מספקים פרוטוקול לשיבוט קלטות טרנסגניות, ייצור וקטורים גולמיים והתמרה של תרביות תאים.

ביטוי טרנסגנים בתאים בתרבית באמצעות וקטורים נגיפיים רקומביננטיים לא מטוהרים הקשורים באדנו

המחקר הנוכחי מתאר תהליך ריצוף ננו-נקבוביות של פלסמידים כאשר רצף הכרומוזומים כבר ידוע או אינו מעניין. שלב העשרת DNA בפלסמיד מבטיח עומק אופטימלי של רצף הפלסמידים וממקסם את מספר הדגימות שניתן לרצף בכל תא זרימה.

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

למד כיצד לטהר DNA ממושבות חיידקים באמצעות ערכת Miniprep של Qiagen לצורך מוטגנזה מכוונת אתרים. שיטה זו מאפשרת הכנת פלסמידים לריצוף ואימות מוטציות בקלות וביעילות.

טיהור פלסמיד דנ"א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

גלה סרטונים נוספים