זיהוי תוצרי ביניים של רפליקציית dsRNA של נגיף הזיקה באמצעות אימונוסייטוכימיה

התחילו עם פלטה רב-בארים המכילה תאי אפיתל שהודבקו בנגיף זיקה (Zika virus), נגיף RNA גמיש (single-stranded RNA virus).

במהלך הזיהום, הנגיף משחרר את ה-RNA המהווה תוצר ביניים של RNA דו-גדילי או dsRNA.

כדי לזהות ביניים אלו של dsRNA, החליפו את המצע במתנול כדי להחדיר חומרים לתאים (permeabilize) ולשמר את שלמות התא.

הסר את המטנול ושטוף בעזרת בופר.

הוסיפו תמיסת חסימה למניעת קישור לא ספציפי של נוגדנים.

הוסיפו נוגדן ראשוני הספציפי ל-dsRNA של הנגיף.

דגרו עם נענוע עדין בטמפרטורה נמוכה כדי לאפשר לנוגדן הראשוני להיקשר ל-dsRNA הוויראלי.

שטפו עם באפר, הוסיפו נוגדן משני המצומד לפלואורופור אדום והדגירו.

הנוגדנים המשניים נקשרים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו עם בופר, ולאחר מכן הוסיפו צבע פלואורסצנטי נקשר ל-DNA כדי לצבוע את הגרעין.

צפו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי להדמיא את תוצר הביניים של ה-dsRNA הנגיפי המסומן בתוך התא המודבק.

עבור אימונוציטוכימיה, הסיר את המצע מהבארים של פלטת 12-הבארים, והוסף מיליליטר אחד של מתנול לכל באר. אפשר לתאים לעבור קיבוע בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף את התאים המקובעים שלוש פעמים ב-1x PBS. לאחר מכן הוסף באפר חסימה (blocking buffer) והדגר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. דלל את הנוגדן המונוקלונלי לעכבר נגד RNA דו-גדילי J2 ביחס של 1:100 בבאפר חסימה, הוסף אותו לתאים, והדגר את התאים