Name: בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-08T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: למד שיטה לאופטימיזציה של בידוד תאי גזע מבלוטות הרוק של עכברים תוך שימוש בעיכול אנזימטי ומכני. הפרוטוקול מאפשר יצירת תרביות סליספרות עם תכונות של תאי גזע לחקר רפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. ריג'נט הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצפת: 1% (w / v) בסרום שור אלבומין תמיסת מלח מאוזנת של האנק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזימים מחדש. אנזים Hyaluronidase: 40 מג / מ"ל, מומס חיץ. Collagenase II: 23mg / mL, מומס חיץ. השתמש טרי פתרונות אנזים מוכן טרי בידוד כל אחד. כאשר מומס, לאחסן ב 4 ° C עד השימוש לעיכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 mM סידן כלוריד במים מזוקקים. סנן לעקר דרך פילטר בגודל 0.2 UM הנקבוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר בלוטת הרוק (MSG) בינוני תרבות: DMEM: F12 עם פניצילין (100 IU / mL), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), glutamax (2 מ"מ), גידול אפידרמיס גורם-2 (20 ng / mL), גורם הגדילה פיברובלסטים אינסולין -2 (20 ng / mL), N2 תוספת (1%), (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו dexamethasone (1 מיקרומטר). </li></ol> 2. רקמות מכונות עיכול אנזימתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בלוטות הרוק גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים בלוטות לתערובת הומוגנית באמצעות מספריים סטרילי לנתיחה מעוקל בצלחת פטרי קטנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמות טחון ב 14 צינורות מ"ל, באמצעות 1mL של חיץ לכל רקמה submandibular 80mg. שוטפים את בצלחות פטרי נקי של רקמה בעזרת כמה למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ"ל של חיץ לכל רקמה 80 מ"ג, ואחריו פתרון אנזים 25 μL II collagenase, 25 פתרון μL אנזים hyaluronidase ו 250 סידן כלוריד μL פתרון לכל רקמה 80 מ"ג. אם עובדים עם כמויות גדולות של רקמה, צעדים 2.4-2.9 ניתן לבצע T25 תרבות צלוחיות רקמות לנוחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את waterbath רועד להגדיר 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לתערובת אנזים ביסודיות דרך רקמות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף ב waterbath לעוד 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 400, למשך 8 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend במאגר 2 מ"ל של כל רקמות 80 מ"ג, ולחזור האנזים סידן כלוריד בנוסף לעיל. דגירה 20 דקות באמבט מים רועד. הסר צינורות triturate ידי פיפטה לערבב אנזימים ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 20 דקות האחרון רועד אמבט מים. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה לעיל, להשליך supernatant. </li></ol> 3. כביסה שלבים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל 80 מ"ג של רקמות החיץ 2 מ"ל ו פיפטה לשטוף רקמה חופשית של אנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף באמצעות חיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג. צנטריפוגה לאסוף, להשליך supernatant. </li></ol> 4. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פתרון רקמות החיץ 1 מ"ל לכל רקמה 80 מ"ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת הפתרון לסינון 100 מיקרומטר נקבוביות בגודל ממוקמים מעל הצינור פלקון 50 מ"ל. אין ליישם יותר מ -3 MLS של פתרון רקמות טחון לכל עמודה, כמו מסנני עלול להיחסם. אפשר לחלחל. הסרת חומר מסונן תלוי התחתון של סינון לפי פיפטה, ומוסיפים תסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק עם מחט 26 מד לקחת תסנין מ 50 מ"ל צינורות חלים 50 מיקרומטר מסננים גודל הנקבוביות על 5 צינורות מ"ל. אפשר לסנן דרך, סיוע על ידי שחרור מכסים במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות צנטריפוגה כמו בעבר לאסוף. בטל supernatant. </li></ol> 5. ציפוי ובינוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את כל הגרגרים לתוך בכרך אחד. ספירה באמצעות מונה תא haemocytometer אוטומטיות או. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פלייט בצפיפות של 0.4 x 10 6 תאים לכל גם צלחת 12 היטב, או 2.67 x 10 6 תאים לכל בקבוק T25 בתרבית רקמה. הוסף 1 מ"ל MSG בינוני עד טוב כל או 6 מ"ל ל T25 כל בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 ° C. Spheres צריך להיות לעין ביום 2. </li></ol> 6. נציג תוצאות: אחרי יומיים שלושה בתרבות, אגרגטים של תאים קטנים (salispheres) יהיה ניכר התרבויות. Salispheres ימשיך לגדול בגודל על פני תקופה של עשרה ימים בתרבות. נציג בניגוד לשלב תמונות של מיקרוסקופיה salispheres מוצגים באיור 1. התאים מתרבים להביע תא גזע חלבונים הקשורים הסמן יכול להיות מבודד בתחומים אלה, בצורה אופטימלית בין בידוד 3-5 שלאחר ימים, ומסוגלים הבחנה לתוך תפקודית, רוק לייצר תאים acinar. <img src="/files/ftp_upload/2484/2484fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. היווצרות Salisphere במבחנה. בעקבות עיכול מכני אנזימטיות באמצעות פרוטוקול הנוכחי, תחומי הגדלת גודל ניתן למצוא בתרבויות צף. לוחות מייצגים בניגוד שלב מיקרוסקופיה תמונות של תחומים מהימים 0 (א), 4 (ב), 7 (ג) ו 10 (ד). בר סולם = 50 מיקרומטר.

<ol><li>Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Sequelae+of+Head+and+Neck+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oral+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy.</a> Crit Rev Oral Biol Med. 14, 199-212 (2003).</li>
<li>Nape&ntilde, as, J, J., Brennan, M. T., Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+treatment+of+xerostomia+%28dry+mouth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Odontology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and treatment of xerostomia (dry mouth).</a> Odontology. 97, 76-83 (2009).</li>
<li>Denny, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenchymal+cell+proliferation+and+mechanisms+for+maintenance+of+granular+duct+and+acinar+cell+populations+in+adult+male+mouse+submandibular+gland%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Parenchymal cell proliferation and mechanisms for maintenance of granular duct and acinar cell populations in adult male mouse submandibular gland.</a> 235, 475-485 (2005).</li>
<li>Man, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+a+perinatal+cellular+phenotype+in+submandibular+glands+of+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Persistence of a perinatal cellular phenotype in submandibular glands of adult rat.</a> J. Histochem. Cytochem. 43, 1203-1215 (1995).</li>
<li>Cotroneo, E., Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+acinar+cells+following+ligation+of+rat+submandibular+gland+retraces+the+embryonic-perinatal+pathway+of+cytodifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of acinar cells following ligation of rat submandibular gland retraces the embryonic-perinatal pathway of cytodifferentiation.</a> Differentiation. 79, 120-130 (2010).</li>
<li>Eirew, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+quantifying+normal+human+mammary+epithelial+stem+cells+with+in+vivo+regenerative+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A method for quantifying normal human mammary epithelial stem cells with in vivo regenerative ability.</a> Nat Med. 14, 1384-1389 (2008).</li>
<li>Gorjup, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glandular+tissue+from+human+pancreas+and+salivary+gland+yields+similar+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glandular tissue from human pancreas and salivary gland yields similar stem cell populations.</a> European Journal of Cell Biology. 88, 409-421 (2009).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+skin+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the skin epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 1. 11830-11835 (2003).</li>
<li>Lombaert, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> Plos One. 3, e2063-e2063 (2008).</li>
<li>Coppes, R. P., Goot, A. vander, Lombaert, I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+to+Reduce+Radiation-Induced+Normal+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy to Reduce Radiation-Induced Normal Tissue Damage.</a> Seminars in Radiation Oncology. 19, 112-121 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השיטה המתוארת כאן בתרבית רקמה מייצג פרוטוקול לשחזור עבור בידוד של התא המכיל גזע salispheres מ בלוטות הרוק של עכברים. מחקרים באמצעות תאים מבודדים בצורה זו הדגישו את יכולת ההתחדשות של בלוטת הרוק בתאי גזע 9. השתלה של 100 של c-Kit + בתאים שמקורם salispheres המושרה התאוששות תפקודית של בלוטות הרוק עכבר מוקרן. נתונים אלה מרגש לספק נקודת התחלה עבור החקירה של טיפול בתאי גזע מבוסס על xerostomia. אפיקים רבים להישאר כדי להיחקר עם זאת, כולל את פרופיל ביטוי מלא חלבון סמן של בתאי גזע, היכולת של בלוטות submandibular להציל את תפקוד בלוטות הרוק הפרוטיד מוקרן ולהיפך, ואת האפיון של המשוערת בנישה של תא גזע vivo התאים. בסופו של דבר, את התרגום של פרוטוקול זה דגימות רקמה אנושית ואת הפוטנציאל הבאים לטיפול של xerostomia בחולים אנושיים באמצעות תאים מבודדים הוא היישום המלהיב ביותר של השיטה המתוארת.

<table><tbody><tr><td>היאלורונידאז (Hyaluronidase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>לאחסן ב- &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>קולגנאז II (Collagenase II)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>לאחסן ב- 4 &amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי-2 (Epidermal Growth Factor-2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>להכין תמיסת מלאי בריכוז 10 &amp;#x03BC;g / mL בתמיסת סליין פוספטית (PBS). לאחסן ב- &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C באליקוויטות לשימוש חד-פעמי.</td></tr><tr><td>גורם גדילה לפיברובלסטים-2 (Fibroblast Growth Factor-2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>להכין תמיסת מלאי בריכוז 25 &amp;#x03BC;g / mL ב- PBS. לאחסן ב- &amp;#8211; 20 &amp;#x00B0;C באליקוויטות לשימוש חד-פעמי.</td></tr><tr><td>תוסף N2</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>לפי הוראות היצרן.</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>להכין תמיסת מלאי בריכוז 2 mg / mL במי ברז. יש לכוון את ה- pH של המים ל- 2-3 באמצעות חומצה אצטית גלציאלית לפני ההמסה.</td></tr><tr><td>דקסמתזון (Dexamethasone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאים סטריליים עם גודל נקבוביות של 100 &amp;mu;M</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה עם מכסי מסנן תאים (גודל נקבוביות 50 &amp;mu;M)</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

בלוטות הרוק הן מבוגרות ממוצא אנושי עכבר מהווים מינימום של חמישה סוגי תאים, שכל אחד מהם מאפשר ייצור והפרשה של הרוק לחלל הפה. תאים acinar הצפק ו רירי הם חלבונים מפעלים לייצור הרירי של בלוטת בהתאמה, המייצגים את מקורו של ייצור הרוק. מסונתז פעם, המרכיבים השונים proteinaceous האנזימטית אחרים של רוק מופרשים דרך סדרה של תאים אפיתל ductal נושאות מסוג מורפולוגיה, עד הגירוש הסופי של הרוק דרך צינור אחד גדול לתוך חלל הפה. הרכב הרוק הוא שונה גם על ידי תאים ductal במהלך תהליך זה. בשנת ביטוי של מחלות כגון תסמונת סיוגרן, ובכמה מצבים קליניים כגון טיפול הקרנות לסרטן הראש והצוואר, ייצור רוק על ידי בלוטות מצטמצם באופן דרמטי 1,2. Xerostomia וכתוצאה מכך, תחושה סובייקטיבית של יובש בפה, משפיע לא רק על היכולת של החולה לבלוע ולדבר, אלא גם מעודדת את התפתחות עששת שיניים יכול להיות מתיש חברתית הסובל. שיקום ייצור הרוק הנ&quot;ל תנאים קליניים ולכן מהווה צורך קליני מסופקים, וכן מספר מחקרים כאלה הוכיחו את יכולת ההתחדשות של בלוטות הרוק 3-5. בהמשך בידודה של דמוי תא גזע אוכלוסיות של תאים מרקמות שונות בתוך העכבר גופות אדם 6-8, הראינו באמצעות השיטה המתוארת כי תאי גזע שבודדו בלוטות הרוק העכבר יכול לשמש כדי להציל את ייצור הרוק הרוק מוקרן בלוטות 9,10. תגלית זו סוללת את הדרך לפיתוח טיפולים מבוססי תאים גזע לטיפול התנאים xerostomic בבני אדם, וגם חקר של בלוטת הרוק כמו microenvironment המכילה תאים בעלי יכולת חידוש עצמי multipotent.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור בידוד של בתאי גזע מבלוטת הרוק עכבר מתואר. שיטה מעסיקה עיכול אנזימטי מכני, והיתרי הבידוד של salispheres המכילה תאים בעלי מאפיינים של בתאי גזע.

בלוטות רוק בוגרות, הן ממקור אנושי והן ממקור עכברי, מורכבות מחמישה סוגי תאים לפחות, שכל אחד מהם מסייע לייצור ולהפרשה של...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים בידוד של תאי גזע משוערים מבלוטות הרוק של עכברים. פעולה זו משיגה תחילה על ידי קציר בלוטות רוק תת-לסתיות מעכברים בוגרים. השלב השני של ההליך הוא שימוש במספריים קמורות כדי לעבד את הרקמה לדייסה הומוגנית.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא עיכול נוסף של הרקמה באמצעות קולגנז ואנזימי ליאז בעלי פעילות גבוהה יותר. יש להקפיד שלא לעכל את הרקמה יתר על המידה. מכיוון שתגית תאים מלאה אינה מניבה מספר רב של ספירות, מקבצים של שניים עד שלושה תאים הם האופטימליים.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא סינון של ההומוגנאט דרך מסננים של 100 micron ו-50 micron. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות תרבית ובידוד של תאי גזע מבלוטת siv באמצעות שימוש משולב של עיכול מכני ואנזימטי של בלוטות SIV שלמות. ההשלכות של טכניקה זו חוללות לעבר הטיפול ב-Xerostomia, הידועה גם כפי dryness של הפה, ואשר עלולה להיגרם כתוצאה מטיפול בקרינה (radiotherapy).ניתן להשתמש בתאי גזע של בלומי הרוק כדי לטפל ב-Xerostomia בחולים הסובלים מסרטן ראש וצוואר. לפני תחילת הפרוצדורה, יש להכין באפרים, עכברים, תרבית של בלומי רוק, מצעי גידול ותמיסות אנזימים. בהתאם לפרוטוקול הכתוב המצורף, יש לבצע את כל שלבי ההפרדה והתרבית הרקמית בתוך מ couvrir סטרילי לתרבית רקמה.לאחר בידוד וניתוח של בלוטות הרוק של העכבר, שקלו את רקמת בלוטת הרוק על מאזניים ורשמו את המשקל. השתמשו בשפכטל כדי להעביר את בלוטות הרוק לפטרי קטנה, ובעזרת מספרי ניתוח קמורים, קצצו את בלוטות הרוק לעיסה הומוגנית. גזרו את קצהו של טיפ פפיטה P 1000 כדי ליצור פתח רחב יותר.השתמש בכך כדי להעביר בפיפט מיליליטר אחד של בופר לכל 80 מיליגרם של רקמה אל תוך צלחת הפטרי, ואת ההומוגנאט העבר לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר. טפח מיליליטר נוסף של בופר לכל 80 מיליגרם של רקמה על צלחת הפטרי. כדי לאסוף שאריות קטנות של רקמה, הוסף תמיסה זו לשפופרת הצנטריפוגה.לאחר מכן, הוסיפו במהירות 250 µL של תמיסת calcium chloride, 25 µL של תמיסת hyaluronidase ו-25 µL של collagenase. שני תמיסות אנזימים לכל 80 mg של רקמה. הניחו את המבחנה המכילה את תערובת הרקמה והאנזימים במקלחית רוטטת בטמפרטורה של 37 °C והדגרימו למשך 20 דקות.בסיום הדגירה, הוצאו את המבחנות. השתמשו בטיפ של P 1000 עם קצה שהוסר, כפי שנעשה בעבר, כדי לערבב היטב את הרקמה ואת תמיסת האנזים כ-10 פעמים. החזירו את המבחנה למקלח המים בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות נוספות.לאחר תקופת האינקובציה השנייה, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך שמונה דקות; לאחר הסבב, השלף את העלייה (supernatant) והשבה בזהירות את המשקע ב-2 mL של בופר לכל 80 mg של רקמה התחלתית. לאחר מכן, הוסף 250 µL נוספים של תמיסת calcium chloride, ו-25 µL של תמיסת hyaluronidase ו-25 µL של תמיסת collagenase. שתי תמיסות אנזימים לכל 80 mg של רקמה.החזירו את המבחנה לאמבט המים הנע בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. הוציאו את הרקמות מאמבט המים וחזרו על הפעולות כפי שבוצע בדגירה קודמת לאחר סיום הדגירה. סבבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g למשך שמונה דקות.פעם נוספת ולאחר מכן השליכו את העלייה. הרקמה מוכנה כעת לשטיפה כהכנה לסינון לאחר הסבוב הקודם של הצנטריפוגה. העבירו בפיפט 2 mL של בופר לשפופרת ובצעו טריטורציה.ששעו את המשקע לאחר תהליך השחזור (resuspension). סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך שמונה דקות. לאחר מכן, השליכו את העלייה (supernatant) באמצעות פיפטה.הוסף למבחנה מיליליטר אחד של בופר לכל 80 מיליגרם של רקמה, ובצע שוב טריטורציה. זאת כדי להשעות מחדש את המשקע. חזור על הסבוב של הסרקיגציה.סבבו ב-400 ×g למשך שמונה דקות. במהלך הצנטריפוגה, הכינו את שלב הסינון על ידי הנחת מסנן בעובי נקבים של 100 מיקרון מעל מבחנה לצנטריפוגה בנפח 50 מיליליטר; עם סיום הצנטריפוגה, השליכו את העלייה וספגו בעזרת פיפטה כמות סופית של 1 מיליליטר בופר לכל 80 מיליגרם רקמה לתוך המבחנה. השתמשו בטיפ של P 1000 עם קוצבי קצוות, וספגו למעלה ולמטה כדי להבטיח שהמשקע הוסעה באופן יסודי.לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למסנן בעל גודל נקבים של 100 micron ותנו לו לחלחל דרך המסנן אל מבחנת צנטריפוגה של 50 milliliter. חשוב לא להוסיף יותר מ-3 milliliter של הומוגנאט, שכן המסנן עלול להיחסם. אם נפח זה נחלה, השתמשו בפיפט P 1000 כדי להסיר רקמה שנאספה בחלקו התחתון של המסנן והעבירו רקמה זו למבחנת הצנטריפוגה של 50 milliliter המכילה את התסנין.באמצעות מזרק של 1 milliliter המצויד במחט gauge 26, שאבו את ההומוגנאט משפופרת הצנטריפוגה של 50 milliliter והעבירו אותו למכסה המסנן בעל נקביות של 50 micron המותקנת על שפופרת של 5 milliliter. אפשרו להומוגנאט לחלחל דרך המסנן. אם הסינון איטי, שחררו מעט את מכסה המסנן במידה והוא הדוק מדי.סתימה עלולה למנוע סינון כאשר כל ההומוגנאט עבר דרך המסנן אל תוך המבחנה. סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-400 ×g למשך שמונה דקות. לאחר הצנטריפוגציה, התאים ששקעו מוכנים לזריעה בצלחת.את תאי בלוטות הרוק מתחילים על ידי תליה מחדש ב-1 mL של מצע MSG לכל 80 mg של רקמה. ספרו את התאים בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים. במקרה זה, נעשה שימוש בסופר תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התאים.חשבו את נפח תרחיף התאים הדרוש עבור 0.4 × 10⁶ תאים, ומכך את מספר הבארים שניתן לזרוע. הוסיפו מיליליטר אחד של מצע MSG לכל באר בלוח תרבית של 12 בארות. ודאו שתרחיף התאים מעורבב היטב והוסיפו לכל אחת מהבארות את נפח תרחיף התאים הדרוש עבור 0.4 × 10⁶ תאים.העבירו את הפלטות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5% carbon dioxide. לאחר יומיים של דגירה, בחנו את התרביות לנוכחות של כדורי SLOs ולחוסר ב-ace בתאים שלנו. זוהי דוגמה לרקמה מבלוטת הרוק של עכבר שעובדה כמתואר והודמיה באמצעות מיקרוסקופיית ניגוד מופע (phase contrast microscopy) מאפס ועד 10 ימים בתרבית; הצבירים הקטנים של התאים הם כדורי SLOs, אשר גדלים בגודלם לאורך פרק זמן זה.מוצג כאן צביעה אימונוהיסטוכימית של תרבית ייצוגית של כדורי SLOs בני שלושה עד חמישה ימים עבור הסמן לתאי גזע Protein C kit. כפי שניתח באמצעות ציטומטריה זורמת, הביטוי של sea kit מאשש את נוכחותם של תאי גזזים משוערים בתרביות כדורי SLOs. כדורי SLOs בני שלושה עד חמישה ימי גיל יכולים להבדיל עצמם כדי ליצור מבנים דמויי סינכימיה ותעלות עם מורפולוגיה דומה לזו שבבלוטת הרוק הטבעית.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה של האופן שבו מבודלים בלוניות רוק ותאי גזע מבלוניות רוק של עכברים.

isolation-of-mouse-salivary-gland-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרט הווידאו הזה מראה כיצד מיקרו לנתח את שק החלמון ואת אבי העורקים, בלוטת המין, כלית בינים האזור מעוברים ולהשתמש cytometry זרימה למיין בתאי גזע hematopoietic.

בידוד מוקדם בתאי גזע hematopoietic מ Murine חלמון Sac ו AGM

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

פרוטוקול עבור cannulation של בלוטת הרוק עכבר submandibular דרך צינור של וורטון מתואר. לצורך ניסוי זה, הפתרון כחול trypan משמש הצבעים כדי להדגים כיצד טכניקה זו יעילה מספק חליטות לתוך בלוטת ממוקד, ולהציע את האמינות של הגישה החדשה הזו כמו טיפול פוטנציאלי סמים / תא קליניות לגבי רגנרצית של בלוטות הרוק.

Cannulation של בלוטת הרוק באמצעות עכבר Submandibular Duct של וורטון

כאן אנו מראים הפרוטוקול שלנו לבידוד של תאי צינור בלוטה הבזליים וקנה נשימת submucosal מעכבר. גם אנחנו מדגימים את השיטה של ​​הזרקת תאי גזע לכרית השומן הגבה עכבר כדי...

בידוד של תאי בסיס ותאי בלוטת Duct Submucosal מעכבר קנה נשימה

מודל אידיאלי לחקר ביולוגיה של תאי גזע בוגרים הוא זקיק שיער העכבר. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אוכלוסיות שונות של זקיקי שיער, תאי גזע וקרטינוציטים אפידרמיסיים, תוך שימוש בעיכול אנזימטי של עור הגב של העכבר ואחריו ניתוח FACS.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של שלמה, שלמה עכבר פרוטוקול עטין לחקור מורפולוגיה ductal וביטוי מטריצה חוץ-תאית (ECM). בלוטות בטן העכבר #4 היו מופק עכברים nulliparous נקבה שבוע 8-10, קבוע בפורמלין במאגר נייטרלי, למחלקה והמוכתמות בעזרת אימונוהיסטוכימיה ECM חלבונים.

בידוד של בלוטות מוגדלות ללא פגע, כל עכבר לניתוח של בלוטת מורפולוגיה וביטוי מטריצה חוץ-תאית

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

בלוטת lacrimal (LG) יש שני סוגי תאים המבטא α-השריר החלקה אקטין (αSMA): מיואפיתל תאים (mecs) ו קרום הלב. MECs הם של מוצא העורי, נמצא ברקמות הבלוטות רבות, בעוד קרום הלב הם תאים שריר וסקולריים חלקה של מקור אנדועורי. פרוטוקול זה מבודד מנות וכלי קרום.

בידוד של תאים מיואפיתל מתוך למבוגרים מורנה לקטמל בלוטות הלסת

אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.

בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers

הדמיה אימונופלואורסצנטית מוגבלת על ידי היכולת לצפות בתהליכים ביולוגיים מורכבים ותלויי זמן בתמונת מצב אחת בלבד בזמן. מחקר זה מתאר גישת הדמיה חיה שנערכה על פרוסות בלוטות תת-לסתיות של עכברים שנחתכו בחיתוך מדויק. גישה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תא-תא במהלך הומאוסטזיס ותהליכי התחדשות ותיקון.

חקירת אינטראקציות תאים-תאים בבלוטת הרוק באמצעות Ex Vivo Live Cell Imaging

למד שיטה לאופטימיזציה של בידוד תאי גזע מבלוטות הרוק של עכברים תוך שימוש בעיכול אנזימטי ומכני. הפרוטוקול מאפשר יצירת תרביות סליספרות עם תכונות של תאי גזע לחקר רפואה רגנרטיבית.

בידוד של בלוטת הרוק עכבר תאים גזע

גלה סרטונים נוספים