סי אלגנס למידה חיובית Butanone, לטווח קצר, לטווח ארוך מבחני זיכרון אסוציאטיבי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את הזיכרון לטווח קצר ולטווח ארוך של התניה חיובית שנלמדה בין מזון לבין ה-chemo. Attractant butane, תוך שימוש ב-C elegance כמודל. זאת משיגים תחילה על ידי הרעבת תולעים בוגרות צעירות, מסונכרנות ומוזנות היטב, למשך שעה אחת.

בשלב הבא, התולעים מאומנות בנוכחות מזון ובוטאנון (butan known) באמצעות התנייה קצרה (mass conditioning) עבור זיכרון אסוציאטיבי לטווח קצר, ועל ידי התנייה מרווחת (spaced conditioning) עבור זיכרון אסוציאטיבי לטווח ארוך. לאחר ההתנייה, נמדד הכיमोटקסיס לעבר הבוטאנון ונערך השוואה לכימוטקסיס של תולעים נאיביות. כדי לבחון את שימור הזיכרון, מתקבלים תוצאות המראות את משך הזיכרון האסוציאטיבי לטווח קצר וארוך של הקשר הנלמד בין המזון לבוטאנון, בהתבסס על שינויים במדד הלמידה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחומי ההזדקנות הקוגניטיבית והמחלות, כגון אילו מסלולים גנטיים נדרשים לתפקוד נוירונלי בהזדקנות נורמלית ובמצבים של מחלות נוירודגנרטיביות, וכיצד ניתן לשפר למידה וזיכרון. תחת תנאים של ליקוי קוגניטיבי, מכינים תולעים בשיטות סטנדרטיות על פיתחים של מצע גידול בגובה 100 millimeter, המזריעים עם 1 milliliter של OP 50 e coli. השתמש בבוגרים צעירים בצפיפות של כ-5,000 תולעים או פחות לכל פיתח.

אספו את התולעים על ידי מזיגה עדינה של תמיסת M9 buffer על הצלחת וסיבוב עדין לשחרור התולעים. השתדלו לצמצם את העירבוב, שעלול לגרום להיסחפות של חיידקים בלתי רצויים. לאחר מכן, הטו את הצלחת ושאבו את תערובת התמיסה והתולעים מהפינה.

באמצעות פפיט P 1000, העבירו את התולעים לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. יש להיזהר לא לשאוב את התולעים כנגד דופן הפלטה במידה ונותרו תולעים על הפלטה.

חזור על שלב זה פעם אחת או פעמיים. תן לתולעים לשקוע לתחתית המבחנה באמצעות כוח הגרוויטציה. לצורך השגת התוצאות הטובות ביותר, לא מומלץ להשתמש בסנטריפוגה.

לאחר השקיעה, הסירו את הנוזל העליון באמצעות ואקום ושטפו עם לפחות שלושה עד ארבעה מיליליטרים של M nine buffer. פעלו במהירות כדי למנוע הרעבה. חזרו על הליך זה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות.

בשלב זה, ניתן להפריש קבוצת תולעים שתשמש כקבוצה הנאיבית (naive group) במבחני הכימותקסיס שיוצגו בהמשך. כדי להכין את התולעים לאימון, הוסיפו שלוש עד ארבעה מיליליטרים של בופר M9 למבחנה והניחו לתולעים להרעיב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. הכינו את פלטות ההרגלה על ידי מריחה של שני מיקרוליטרים של 10% butanone ב-95% Ethanol בחלק הפנימי של המכסים של פלטות NGM בנ 直ק 60 מילימטרים, אשר זרועות ב-500 מיקרוליטרים של E. coli OP50. הוציאו את הסופינאט (supinate) ממבחנת התולעים המורעבות והשתמשו בפיפט P1000 כדי להעביר 100 עד 200 מיקרוליטרים של תולעים לכל אחת מפלטות ההרגלה. דגרו את פלטות ההרגלה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לאחר ההרגלה.

שטפו את התולעים מהצלחות עם כ-1 ml של באפר M9 והעבירו אותן לפסולת קונית של 15 ml. חזרו על שיטות השטיפה העדינה שהודגמו קודם לכן עד שהבאפר ייראה צלול. לאחר השטיפה, ניתן להוציא תת-קבוצה של תולעים ולבדוק אותן במבחן כימותקסיס כדי שישמשו כקבוצת זמן אפס ללמידה אסוציאטיבית של 1X MAST, לצורך הכנת צלחות המייצגות נקודות זמן נוספות.

העבירו 100 עד 200 מיקרוליטר של תולעים לצלחות NGM בקוטר של 60 מילימטר שזרעו מראש. דגרו את הצלחות הללו לאחר התנאי למשך 0.5, שעה אחת או שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר כל נקודת זמן, שטפו בעדינות את התולעים מהצלחות לתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר, וחזרו על הפעולה פעם אחת עד פעמיים נוספות.

בעזרת באפר M9, תוך ביצוע אותם הליכי שטיפה עדינים, נבדק הזיכרון האסוציאטיבי לטווח קצר באמצעות מבחן כימותקסיס, שיודגם בהמשך. הכינו את פלטות ההתניה ואת התולעים כפי שהודגם עבור אימון לטווח קצר, אך אפשרו לתולעים להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בלבד. לאחר ההדגירה, אספו את התולעים כפי שהודגם קודם לכן.

העבר אותם לצלחות NGM של 60 מילימטר ללא זריעה (UNSEEDED). הרעב את התולעים בצלחות ללא הזריעה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר הרעבת התולעים, שטוף אותן בבופר M9 והחזר אותן לשפופרת קונית של 15 מיליליטר. חזור על שלבים אלו עד להשלמת שבעה בלוקים של התנייה ושישה בלוקים של הרעבה.

עם סיום ההתנייה, שטפו את התולעים מהצלחות ההתנייה חזרה אל מבחנה קונית. כפי שהודגם קודם לכן, ניתן להשתמש בקבוצת תולעים כדי לבחון למידה אסוציאטיבית עם מרווחי זמן של שבע פעמים מיד לאחר ההתנייה. העבירו את שאר אוכלוסיית התולעים לצלחות HGM בנתיב של 100 מילימטר המכילות 1 מיליליטר של OP 50.

שוב, העבירו 100 עד 200 microliters של תולעים לכל צלחית כדי להבטיח שיש מספיק חיידקים לתמיכה באוכלוסייה. דגרו את הצלחיות לאחר ההתניה בטמפרטורה של 20 °C למשך 16, 24 או 40 שעות, המייצגות את נקודות הזמן של זיכרון אסוציאטיבי לטווח ארוך, כדי לבחון זיכרון אסוציאטיבי לטווח ארוך של הקשר המוכר בין מזון לבוטאנון. שטפו בעדינות את התולעים מהצלחיות לתוך מבחנה קונית של 15 milliliter, ושוב, פעם אחת או פעמיים עם באפר M9 לאחר כל נקודת זמן, ובחנו את התולעים במערך chemo taxis.

להכנת פלטות בדיקת כימוטקסיס, סמנו את התחתית של פלטות NGM בנפח 100 מילימטר שטרם הוצאו מהמעמד בנקודות סמוכות לדפנות בשלושה מיקומים, כפי שמוצג כאן. טפטפו מיקרולטר אחד של סודיום אזייד בריכוז מולרי 1 בנקודות של חומר הריח והבקרה. בצעו זאת לא יותר מ-15 דקות לפני תחילת הבדיקה כדי למזער את הדיפוזיה של חומרי השיתוק.

בנקודה הבאה, טפטפו מיקרוליטר אחד של 95% ethanol ומיקרוליטר אחד של 10% butone בנקודות המתאימות בלוח הבדיקה המסומן. יש להוסיף אותם מעל נקודות ה-sodium azide שסומנו קודם לכן. הסירו כמה שיותר מ-M nine buffer מהמבחנה של התולעים ששקעו.

השתמשו בפיפט P 20 עם טיפ חתוך כדי להעביר 15 µL של תולעים בשלושה מרווחים של 5 µL לנקודת ההתחלה של לוח הבדיקה. לאחר מכן, גלגלו את פינת נייר ניגוב מסוג Kim wipe לנקודה קטנה והשתמשו בה כדי לספוג את עודפי תמי,) M9. היזהרו לא לדקור את האגר.

הסרת עודפי הבופר משחררת את התולעים אל פלטת הבדיקה. אם משתמשים בדימוי לצורך ספירת התולעים, תמונה של נקודת המוצא מיד לאחר שחרור זה תספק את המספר הכולל של בעלי החיים בפלטת בדיקה אחת. דגרו את פלטת בדיקת הכימוטקסיס למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר לאחר הדגור, וספרו את מספר התולעים בנקודות המוצא של האתנול והבוטנון, כמו גם את המספר הכולל של התולעים על פלטת הבדיקה.

בדרך כלל, תולעים ששורשתו שותקה על ידי sodium azide יימצאו ברדיוס של סנטימטר אחד מהנקודות וייראו ישרות לחלוטין. כאשר מספר רב של בעלי חיים נערמים זה על זה, ניתן לספור את התולעים ידנית או לכמת אותן באמצעות תוכנה לדמיון וניתוח. אנו מעדיפים את האפשרות השנייה בשל הנוחות ואמינות התוצאות.

לאחר כיבוי התוצאות של התולעים בנקודות המקור של האתנול והבוטון, חשבו את מדד ה-KeyAx כפי שמוצג כאן. מדד הכימוטקסיס הנאיבי הטיפוסי עבור תולעי סוג בר המגיבים ל-10% Butone הוא סביב 0.2. אימון מרוחק או מרווח מעלה בדרך כלל את מדד ה-CHEMOTAXIS ל-0.7 עד 0.8 בזמן אפס, מה שנותן מדד למידה של כ-0.6.

כימוטקסיס נאיבי רגיש מאוד לטיפול נכון בתולעים. איור זה מדגים את ההבדל הבולט ב-CI בין תולעים נאיביות שהוזנו היטב לבין תולעים רעבות, ומדגיש את החשיבות של טכניקה נכונה. שימור הזיכרון בא לידי ביטוי בזמן שלוקח למדד הכימוטקסיס לחזור לרמות נאיביות כאשר מדד הלמידה שווה לאפס בבעלי טיפוס בר

זיכרון אסוציאטיבי לטווח קצר מתחיל לדעוך שעה אחת לאחר אימון המוני שנמשך כשעתיים, והוא אינו תלוי בגורם השעתוק Creb בהשוואה לזיכרון לטווח ארוך. זיכרון אסוציאטיבי לטווח ארוך בדרך כלל אינו מתחיל לדעוך באופן משמעותי עד 16 שעות לאחר אימון מרווח שנמשך עד 40 שעות, והוא תלוי ב-Creb. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי בדיקות כיmotaxis עשויות להיות מושפעות מהרעבה או מריחות חזקות מדי בסביבה, וכן כי הזיכרון והתולעים עלולים להיפגע מעוררות פיזית מרובה מדי.